文档介绍：xxx菌XX酶
基因工程菌的构建与发酵优化
硕士学位论文答辩
研究生:XXX
指导老师:xxx 教授
xxx 副教授
xxx 副教授
碱性果胶酶(PGL,. )
可在高pH条件下以反式消去作用断开果胶聚合物主链,裂解产物为△4:5不饱和的寡聚半乳糖醛酸
碱性果胶酶概述
碱性果胶酯裂解酶主要来源于细菌和霉菌,其中细菌以Bacillus和Erwinia为主
纺织行业
不同来源的PGL分子量差别较大,范围为23-74kDa,最适pH 为8-11,其生化特性的差异可能是多种形式果胶存在的原因
其他领域
食品行业
纺织品前处理的酶法工艺流程
生物法节能、水,低污染
提高产品质量
环境污染和能源危机
纺织工业高污染、高能耗
Singeing
Desizing Scouring
Bleaching
退浆
精练
角质和果胶质
漂白
淀粉酶/PVA降解酶
角质酶/碱性果胶酶
过氧化氢酶
上浆
碱性果胶酶概述
国内外碱性果胶酶基因工程菌研究情况
宿主
载体
培养策略
发酵
时间(h)
DCW
(g L-1)
PGL
酶活
(U ml-1)
生产
强度
(U L-1h-1)
参考文献
P. pastoris X-33
Invitrogen
摇瓶发酵
120
.
20 to
(Liu et al., 2006)
P. pastoris GS 115
Invitrogen
山梨醇和甲醇
混合流加
低温诱导
96
143
1593 to
(Wang et al., 2010)
E. coli BL21 (DE3)
pET22b(+)
DO-stat 甘油流加
培养温度37 oC
13
8
37 a,b, ex
(Matsumoto et al., 2002)
E. coli Turner (DE3) plac I
pET28a(+)
摇瓶发酵
诱导温度20 oC
60
.
360 b,in
(Zhao et al., 2007)
E. coli JM109
pHsh
分批发酵
温度诱导型菌株
25
20
22 ex
(Zhuge et al., 2007)
毕赤酵母
发酵周期长
工艺流程复杂
低温诱导能耗高
原核表达体系
酶活水平高
工艺流程简单
发酵周期短
异源蛋白
分泌表达
目的蛋白
自身特性
过程
控制
策略
表达
系统
特性
培养基组成
流加策略
诱导方法
诱导后流加策略
VS
异源蛋白分泌表达
重组大肠杆菌的分泌表达
异源蛋白
分泌表达
目的蛋白
自身特性
过程
控制
策略
表达
系统
特性
培养基组成
流加策略
诱导方法
诱导后流加策略
VS
异源蛋白分泌表达
重组大肠杆菌的分泌表达
生物量
比产率
分泌比率
After
胞外PGL
胞内PGL
包涵体
胞外PGL
胞内PGL
包涵体
Before
研究思路
大肠杆菌
枯草芽孢杆菌
摇瓶水平
发酵罐水平
摇瓶水平
1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素
重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究
流加培养过程诱导时机的研究
4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
5. 重组碱性果胶酶
粗酶性质的初步研究
原核宿主表达体系
菌体量
比生产
分泌比率
1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
Digestion and ligation
ATG
pET20b(+)/pgl
pgl
Fnew-S/Fnew-A
PCR
ATG
TAA
Bacillus sp. WSHB04-02
genomic DNA
pgl Kb
PGL基因PCR扩增片段鉴定
重组质粒酶切验证
(bp)
2000
1000
750
1 M
2637
1208
(bp)
2000
1000
750
1 M
1. 小结
发酵上清SDS-PAGE电泳分析
PL(43kDa)
43 kDa
PGL
(kDa)
1 M
将PGL-1638序列进行测序,得到Bacillus sp. WSHB04-02的PGL相关1638 bp的基因,将其CDS部分(1263 bp)在NCBI进行BALST分析,表明本研究克隆到的PGL基因与Bacillus subtilis SO113(NCBI A