文档介绍：基因诊断与基因治疗
基因诊断(gene diagnosis)
是以DNA和RNA为诊断材料,通过检查基因的存在、缺陷或表达异常,对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。
基本原理
检测DNA或RNA的结构变化与否,量的多少及表达功能是否正常,以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化,以此作为疾病确诊的依据。
(一) 基因诊断
1、基因诊断的概念和特点
基因诊断的特点:
①以基因作为检查材料和探查目标,属于“病因诊断”,针对性强。
②分子杂交技术选用特定基因序列作为探针故具有很高的特异性。
③由于分子杂交和聚合酶链反应(PCR)技术都具有放大效应,故诊断灵敏度很高。
④。检测目标可为内源基因也可为外源基因。
临床意义在于不仅能对疾病作出早期、确切诊断,而且也能确定个体对疾病的易感性及疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等。
基因突变的类型
(1)大片段DNA的缺失、插入和重排。
(2)移码突变在基因编码序列中缺失或插入一个或几个碱基(非3的整倍数),可以使突变位点之后的三联体密码阅读框发生改变,不能编码原来的正常蛋白质,即所谓移码突变。
(3)点突变致密码子改变无义突变、错义突变、同义突变
(4)动态突变三核苷酸重复单位膨胀
3、基因诊断的基本方法

(1)核酸分子杂交
Southern印迹法能检出特异的DN***段,而且能测定分子量,可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。
Northern印迹法可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。
原位杂交可查明染色体中特定基因的位置,并检出基因和基因产物的亚细胞定位,用于染色体疾病的诊断。
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
抽提总RNA
逆转录合成cDNA
***纤维素滤膜
同探针同源杂交的cDN***段
X光底片
Northern 凝胶转移杂交技术
(2)聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)
PCR基本工作原理:
通过控制温度重复进行DNA模板解链(变性)、引物与模板DNA结合(退火)、DNA聚合酶催化新生DNA的合成(延伸)三个步骤, 不断循环使DNA得到大量复制。
①变性(denature):加热至95℃左右,使DNA形成单链模板。
②退火(annealing):温度降至55 ℃左右或以下,引物与DNA模板互补,形成杂交链。
引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。
③延伸(extension):温度升至70℃左右时,Taq DNA聚合酶催化以引物为起始点的5’→3 ‘ DNA链延伸反应,形成新生DNA链。
赖热DNA聚合酶(Taq酶)
1969年从美国黄石公园火山温泉的水栖嗜热菌中分离提纯
循环30次,介于两个引物之间的新生DN***段理论上达到230拷贝,约为109个分子。