文档介绍：实验内容
(PFC测定)
(ELISA)(示教)
(标本片)
实验三
溶血空斑试验(PFC测定)
实验目的:
;
2. 了解PFC试验的临床意义。
实验原理
溶血空斑试验(Hemolytic plaque technique,Plaque—forming cell assay)是检测和计数抗体形成细胞的一种常用方法。
原理是将绵羊红细胞(SRBC)免疫过的小鼠脾细胞制成的细胞悬液,与一定量的绵羊红细胞混合,在补体的参与下,使抗体产生细胞周围SRBC溶解,形成一个肉眼可见的空斑或溶血现象。
主要用于检测B细胞的抗体生成能力。
实验材料
~22g。
%、15%SRBC。
(补体)。
's液。
(剪刀、镊子)、解剖板。
、15目钢网、组织研磨器、注射器、吸管、毛细滴管、试管、微量加样器。
、酒精灯、石蜡、石蜡锅等。
实
验
流
程
混匀,灌注小室,37℃放置l小时,观察结果
5%
4d
100μl 脾细胞悬液
200μl 补体
颈椎脱臼处死小鼠,取脾脏,用Hank’s液漂洗,在无菌平皿中剪碎,200目钢网制成脾细胞悬液
洗涤:1000r/min×10min
去上清,加Hank’s液制成1×107/m1脾细胞悬液
15%SRBC 200μl
1mlHank’s液
实验方法
:5%SRBC lml无菌操作注射于小鼠腹腔。
2. 脾细胞悬液制备:四天后颈椎脱臼处死小鼠,取脾
脏,去脂肪和筋膜,用Hank’s液漂洗,在无菌平皿中剪
碎,用组织研磨器在200目钢网内研磨制成脾细胞悬液。
:取研磨液1ml放于小试管中,加满Hank’s液,混
匀、离心1000rpm10min。
,加Hank’s液使沉淀的脾细胞恢复1ml体积。
:取脾细胞 100 微升
15%SRBC 200微升
补体 200微升
Hank’s液 1毫升
:混匀后,用尖吸管灌小室,封蜡、标记,放37℃温箱37℃保温30~60min,观察结果
结果:
计数空斑总数,并换算出每百万脾细胞中所含抗体形成细胞数。如用于筛选药物,可比较给药组和对照组每1×106个脾细胞中抗体形成细胞(即溶血空斑)数的平均值,以表示并比较药物对机体产生抗体能力的影响程度。
右图显示一个 B 细胞位于空斑中央。
【注意事项】  1. 一般选用纯系小鼠。  ,琼脂平板制备时要使琼脂完全溶解,加入脾细胞时应检查是否充分均匀分布,因一时性的冷激会导致形成小的凝胶灶,造成观察和判断困难。  。  4 .摘除的脾不宜立即放入冰浴中的液体中,可显著降低空斑计数。
酶联免疫吸附试验(ELISA)-双位点法检测麻疹病毒IgG抗体(示教)