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组转染后的HEK-293细胞继续培养714d,每4872h更换培养液(视细胞状态确定)。在该继续培养的714d期间,若细胞出现病变既重悬细胞,,并于-80°C/37°C反复冻融3次,冻存备用。若细胞在此期间未出现病变,用IOml完全培养液重悬细胞,并置IOcm细胞培养皿内继续培养714d,此期间若出现病变则按上法操作,若未出现病变则需重复转染操作。3、重组病毒的筛选按上法制备单层HEK-293细胞,至细胞长至80%融合时弃去培养液,用Hank's液洗两次。取上述重组病毒原液500μ1接种于6孔板的HEK-293细胞,置37°C、5%CO2细胞培养箱内作用4h,补加DMEM完全培养液至3ml,继续培养至出现病变。刮取独立病变处细胞,并置于500μ1无血清、无抗生素的DMEM培养液中,按上法冻融3次备用。4、重组腺病毒的扩增及制备于24孔细胞培养板制备单层HEK-293细胞,至细胞长至80%融合时弃去培养液,用Hank's液洗两次。取单克隆重组腺病毒300μ1接种于24孔板的HEK-293细胞,置37°C、5%C02细胞培养箱内作用4h,补加DMEM完全培养液至3ml,继续培养至出现病变。重悬病变细胞并冻融3次,接种于25ml细胞培养瓶内的HEK-293细胞,置37°C、5%CO2细胞培养箱内作用4h,补加DMEM完全培养液至3ml,继续培养至出现病变。重悬病变细胞并冻融3次,置-80°C冻存备用(即为Ad-VT或Ad-VP)。5、重组腺病毒的毒价测定于96孔细胞培养板制备单层HEK-293细胞,至细胞长至80%融合时弃去培养液,用Hank's液洗两次。取制备的单克隆重组病毒以Hank's液进行IO3IO14稀释,取30μ1接种于96孔板的HEK-293细胞,置37°C、5%CO2细胞培养箱内作用4h,补加DMEM完全培养液至200μ1,继续培养7296h。吸弃培养液,补加含***纤维素和2%小牛血清(FCS)的DMEM作为维持液,37°C、5%CO2培养箱中继续培养2448h。吸弃培养液,用PBS洗涤2次,室温下甲醛固定15min,,蒸馏水冲洗后在倒置显微镜下统计病毒空斑数,按如下公式计算出每毫升病毒液中所含的空斑形成单位(Plaqueformingunits,PFU)=PFU=(病毒空斑数X稀释倍数)/接种体积。成功构建了抗肿瘤双特异重组腺病毒Ad-VT(或Ad-VP),应用RT-PCR、Westernblot和IFA等方法,分别对以上重组腺病毒进行了鉴定,证明重组腺病毒所携带外源基因能够有效转录并表达。通过连续传代的方法,对上述重组腺病毒的稳定性进行鉴定。结果表明,本发明所构建的重组腺病毒具有良好稳定性,且病毒毒价可维持在IO7IO8的水平。实施例3重组腺病毒对肿瘤细胞的杀伤作用消化处于对数生长期的肿瘤细胞(人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞0fepG_2)、人