文档介绍：岳续朋
生物工程教研室
实验三质粒的制备及目的基因的扩增
实验目的:
1、了解质粒DNA提取的方法;
2、掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及方法;
3、熟悉常用试剂的配制方法。
第一部分:质粒的提取
实验原理:
质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子。大多数质粒都是双链的共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)分子,天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
细菌裂解
细胞的裂解方法很多,如去污剂法、沸水热裂法、碱变性法、有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊,一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择
[原理] 细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,相互缠绕成大型复合物,被十二烷基硫酸盐包盖,当用钾离子取代钠离子时,复合物会从溶液中有效沉淀下来,离心去除后,就可从上清液中回收质粒DNA。
碱裂解法(Alkaline )
碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分:
Solution I: 50mMl 葡萄糖/ 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl,pH=;Tris-HCl的作用是提供合适的pH值,EDTA的作用是抑制DNA酶的活性,葡萄糖的作用是悬浮;
Solution II: NaOH / 1% SDS;作用是使细胞裂解;(都要新鲜配制)
Solution III: 3Ml 醋酸钾/ 2Ml 醋酸;作用:SDS与醋酸钾形成十二烷基硫酸钾(PDS,沉淀),而蛋白容易和SDS结合,所以蛋白被沉淀下来,而长长的基因组DNA也被沉淀下来。
质粒抽提试剂盒的使用
注意事项:
1、如果是手提质粒,溶液2一定要现配现用;
2、加溶液1时,一定要将菌块完全悬浮,不能有团块,否则会影响细菌的裂解;
3、加溶液2和3时,不能剧烈震荡,以免使基因组DNA断裂,不能完全被沉淀下来;
第二部分:目的基因的扩增
目的:
1、了解引物设计的原理;
2、掌握PCR技术的原理及操作。