文档介绍：该【T载体与目的基因连接 】是由【青山代下】上传分享，文档一共【5】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【T载体与目的基因连接 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。,有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中,:,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,,:首先,T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,’-T载体是一种已经线性化的载体,载体每条链的3’,pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中,℃,即12-16℃,连接12-16h〔过夜〕,这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,,丢失部分膜蛋白,-半乳糖甘酶显色反应选择法LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因,可以编码β——半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体,-Gal为底物进行染色时,〔比如pUC/pBS等〕,常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸〔α肽段〕的编码序列,在这个编码序列里还插入一个多克隆位点〔MCS〕,,常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列〔β肽段〕,,这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—,在培养基诱导物IPTG的诱导下,载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端〔α肽段〕,这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列〔β肽段〕互补,形成完整的β—,会造成lacZ基因不能表达,从而不能合成β—半乳糖核苷酶;而对于空载体,lacZ基因正常表达,通过α互补1/5合成β—半乳糖核苷酶,分解培养基里的色素底物X-gal,最终形成蓝色的化合物,:清洗,5个100ml锥形瓶〔外加1个小的〕,6副培养皿,3个小试剂瓶,接种环,:LB300ml<液体50ml+50ml,固体100ml>,,100mg/mlAmp1ml,20mg/mlX-gal1ml,200mg/=:5个100ml锥形瓶〔外加1个小的〕,6副培养皿,3个小试剂瓶,接种环,涂布棒,10ml超纯水,LB培养基,,大小枪头,过滤用具2副,,-galX-gal为5-溴-4-***-3-吲哚-β-***〔DMF〕溶解X-gal配制成的20mg/ml〔-gal,用DMF定容为1ml〕,装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而坏,并应贮存于-20℃.X-gal溶液无须过滤除菌.〔DMF二***甲酰***;Dimethylformamide;N,N-Dimethylformamide;DMF;CAS:68-12-2理化性质:无色、淡的***-H7-N-<25℃>.熔点-61℃.℃.〕溶于DMSO,溶解度可达20mg/,溶解度可达20mg/.2gIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,,贮存于-20℃.LB培养基:配制每升培养基,应该在950ml去离子水中加入:..〔〕:***化钙固体定容至10mlAmp〔100mg/ml〕:,最后定容至1ml,〔一〕.目的基因片段与载体连接器材2/5旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,,双面离心管架,台式离心机,,T4DNA连接酶,连接酶缓冲液,:〔1〕事先将干式恒温仪〔或冰盒里的水〕温度设定在14~16°C.〔2〕取4个灭菌的200ul微量离心管,加入:〔需要调整〕4ml目的基因;1mlT载体;〔TAKARA,350U/ul〕;1ml连接酶缓冲液10xbuffer;,总量10ml体系.〔3〕述混合液轻轻震荡后再短暂离心,然后置于14°C干式恒温仪〔或14°C水中〕中保温过夜〔12-16h〕.〔4〕连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用.〔二〕.大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化仪器:旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,50ml微量离心管,,台式冷冻离心机,制冰机,恒温摇床,分光光度计,超净工作台,恒温培养箱,摇菌试管,三角烧瓶,接种环,恒温摇床,培养皿〔已铺好固体LB-Amp〕,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱,滤膜和过滤器试剂:,LB培养基,,无菌ddWater,LB培养基〔不加抗菌素〕,LB培养基〔加抗菌素〕,无菌ddwater,IPTG,X-〔1〕在超净工作台中,将1ml大肠杆菌菌液加入100mlLB液态培养基〔不含抗菌素〕,37℃摇床培养过夜.〔2〕,37℃下250r/min摇床培养2~3h,~〔<~,细胞数<108/mL,此为关键参数!〕.〔注意:此步摇菌的时候,要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌〕〔3〕,于冰上放置10min,然后于4℃,5000rpm离心5min.〔4〕将离心管倒置以倒尽上清液,,立即在涡旋混合器上混匀,插入冰中放置30min.〔5〕4℃,5000rpm离心5min,弃上清液后,,插入冰中放置2h,可以直接用作转化实验,或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏.〔6〕事先将恒温水浴的温度调到42℃.〔7〕从-70℃超低温冰柜中取出一管〔100μL〕感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10min.〔8〕加入5μL连接好的质粒混合液〔DNA含量不超过100ng〕,轻轻震荡后放置冰上20min.〔9〕轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克,然后迅速放回冰中,〔4〕提取到的质粒与原先的空载体〔或已知分子量的质粒〕再对比电泳,:提质粒再PCR或酶切鉴定〔1〕在超净工作台中取3支无菌摇菌管,各加入3mLLB〔含50mg/mL氨苄青霉素〕,用记号笔写好编号.〔2〕在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过,,然后将牙签放入盛有3mLLB〔含50mg/mL氨苄青霉素〕,分别装入3个摇菌管中.〔3〕37℃摇菌过夜后,℃冰箱中.〔4〕提取到的3管质粒样品可用PCR法扩增,或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断〔方法见有关实验〕.〔5〕,或取500mL菌液与500mL65%甘油混合后-80℃保存.〔6〕在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面5/5