文档介绍：第二代测序简介
刘云山
第一代测序
第一代技术主要采用1977年Sanger发明的末端终止测序法
在每一轮的Sanger测序反应中,在链延伸的同时加入荧光标记过的ddNTP,被结合的链将终止合成反应,没有被结合的将继续根据模板链合成,一直重复这样的过程直到所有的合成反应都被终止。这样将得到大量长短—末端被同荧光标记的序列,通过电泳对以将不同长度的序列分离开,这样就可以逐个碱基的读出整个序列了。
一个反应所测的序列不可能太长,通常为1000个核苷酸左右,测序通量不大,且测序反应费时费力;
由于DNA聚合酶造成的碱基错配,因此测序的准确度并不高;
基于技术的基因组测序十分昂贵,从基因组中预测基因的方法也十分有限。
测序技术的发展
90年代:
DNA芯片技术
21世纪:
第二代高通量测序技术
第二代测序
第二代测序,即大规模平行测序平台,具有通量大,读长短的特点。
代表技术:
Illumina公司遗传分析仪 (Solexa)  :边合成边测序法;
Roche公司的454平台:焦磷酸合成测序法;
ABI公司推出的SOLiD系统:边连接边测序法。
Illumina -Solexa
基本流程:
。提取基因组DNA,随机打断成100~200bp片段,末端加上接头;
。解链后的单链 DNA 片段两端被分别固定于芯片上, 形成桥状结构,进行桥式PCR扩增。经过PCR扩增,产生数百万条待测的 DNA片段,随后被线性化;
。将荧光标记的dNTP、聚合酶、引物加入到测序通道启动测序循环。DNA 合成时,伴随着碱基的加入会有焦磷酸被释放,从而发出荧光,不同碱基用不同荧光标记,读取到核苷酸发出的荧光后,将3′羟基末端切割,随后加入第2个核苷酸,重复第一个核苷酸的步骤,直到模板序列全部被合成双链DNA。
特点:
测序通量大、速度快、成本低;性价比最高。
Illumina -Solexa
Flow-cell
Roche-454
基本流程:
。将基因组 DNA 打碎成300~800bp的片段后,在两端加上锚定接头;
PCR扩增。每个含有接头的DNA片段被固定在特定的磁珠上,进行乳液 PCR 扩增。多个循环后, 磁珠表面被打破,扩增产生的成千上万个拷贝仍然在磁珠表面;
。将磁珠转移到 PTP板上,每个PTP板上的小孔只能容下1个磁珠。分别装有 A、T、C、G4种碱基的试剂瓶, 依次进入PTP板,每次只进1个碱基,如果发生配对,就会释放1个焦磷酸,释放出的荧光信号会被CCD捕获到。每个碱基反应都会捕获到1个荧光信号,由此一一对应,模板的碱基序列由此获得。
特点:
读长长,但是准确率低、成本高。
Roche-454
乳化:
形成油包水的混合物。
ABI-SOLiD
基本流程:
。将基因组DNA打断,在其两头加上接头,构建成文库;
。此过程与454测序技术类似,不过SOLiD的微珠只有1μm;
。混合的8碱基单链荧光探针为连接反应的底物,探针的5′端用4色荧光标记,3′端第1、2位碱基对应5′端荧光信号的颜色。因为只有四色荧光,而2个碱基却有16个组合情况,故4种碱基对应一种颜色的荧光。单次测序由 5轮测序反应组成,反应后得到的为原始颜色序列。
特点:
通量最大,最准确(>%);但读长最短,双末端测序困难。
ABI-SOLiD