文档介绍：第二十章
高效液相色谱法
高效液相色谱法的特点
一、概述      
 液相色谱法是指流动相为液体的技术。
早期的液相色谱(经典液相色谱)是将小体
积的试液注入色谱柱上部,然后用洗脱液
(流动相)洗脱。这种经典色谱法,流动相
依靠自身的重力穿过色谱柱,柱效差(固定相
颗粒不能太小),分离时间很长。
70年代初期发展起来的高效液相色谱法,克服
了经典液相色谱法柱效低,分离时间很长的缺点。成
为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法是在
经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技
术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达
×107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料
填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米
塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度
的检测器,可对流出物进行连续检测。
二、特点
:
液相色谱法以液体为流动相(称为载液),
液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通
过色谱柱,必须对载液施加高压。一般可达150~
350×105Pa。
2. 高速:
流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般
可达1~10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时
间较之经典液相色谱法少得多,一般少于 1h 。
3. 高效:
近来研究出许多新型固定相,使分离效率大
大提高。
:
高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,
进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度
可达10-12g。另外,用样量小,一般几个微升。
:
GC与HPLC的比较:GC虽具有分离能力好,灵敏
度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术
条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质
都难于应用气相色谱法进行分析。而HPLC,只要求
试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥
发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子
量大(大于 400 以上)的有机物(这些物质几乎占
有机物总数的 75% ~ 80% )原则上都可应用高效
液相色谱法来进行分离、分析。据统计,在已知化
合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相
色谱分析的约占70~80%。
第一节高效液相色谱法的主要类型和原理
一、高效液相色谱法的主要类型
根据分离机制的不同,高效液相色谱法可分为下述几种
主要类型:
1 .液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)
a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。
b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。
—液分配色谱法的缺点:
尽管流动相与固定相的极性要求完全不同,但
固定液在流动相中仍有微量溶解;流动相通过色谱
柱时的机械冲击力,会造成固定液流失。上世纪70
年代末发展的化学键合固定相(见后),可克服上
述缺点。现在应用很广泛(70~80%)。
—固色谱法
(Ion-exchange Chromatography)
凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换
色谱法来进行分离。
4 .离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)
离子对色谱法是将一种( 或多种) 与溶质分子
电荷相反的离子( 称为对离子或反离子) 加到流动
相或固定相中,使其与溶质离子结合形成疏水型离
子对化合物,从而控制溶质离子的保留行为。其原
理可用下式表示:
X+水相+ Y-水相= X+Y-有机相
离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以
分离的混合物的分离问题,诸如酸、碱和离子、非
离子混合物,特别是一些生化试样如核酸、核苷、
生物碱以及药物等分离。
5 .离子色谱法(Ion Chromatography)
用离子交换树脂为固定相,电解质溶液为流动
相。以电导检测器为通用检测器,为消除流动相中
强电解质背景离子对电导检测器的干扰,设置了抑
制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与
离子交换色谱法相同。
离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。
也可用于阳离子分析。