扩增基因全长实验技术.ppt

文档介绍：扩增基因全长实验技术
获取基因全长简介
基因初步验证
基因全长获取(RACE技术)
RACE产物鉴定
4
1
2
3
以介绍5’RACE技术为主
5
对序列进行生物信息学分析
目录
为什么要获取基因全长?
什么是EST?
获取基因全长基本流程?
获取基因全长简介
EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签—是从一个随机选择的cDNA 克隆,进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等,平均长度为360 ±120bp 。
获取全长cDNA是研究
基因功能的关键,是
进行基因功能及产物
分析的必要前提。
获取基因全长基本流程
构建数据库
筛选EST序列
普通PCR进行初步验证
RACE技术
生物信息学分析
库
筛选EST
基因初步验证
获取基因全长
进行全序列分析
以本实验室具体情况为例子
生物信息学分析
Blast比对
ORF比对
相似序列多重比对
家族成员多重比对
PCR扩增
凝胶回收
测序
设计引物
提取RNA
反转录
PCR扩增
Ⅰ电泳检测
Ⅱ凝胶回收
Ⅲ电泳检测
Ⅳ克隆
PCR产物测序
凝胶回收测序
克隆后菌液测序
克隆后质粒测序
基因初步验证
RACE技术
方法
RACE
简介
试剂盒
选取
5’RACE
原理
实验
过程
基因全长获取
cDNA末端快速扩增
(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法。
分为3’RACE 和5’RACE
RACE
简介
Clontech公司
全称:
SMART RACE cDNA amplification kit
优点:
操作简便,成功率较高,全长分子的比例较高
价钱:中等偏上。
缺点:
不知道能否拿到完整的5’UTR.
试剂盒
选取
5’RACE
原理
5’
polyA 3’
Oligo(dT)primer
5’
polyA 3’
cDNA第一条链合成机制
polyA 3’
polyA 3’
3’
5’
5’RACE
原理
polyA 3’
5’
3’
LUP
Suppression PCR:阻抑聚合酶反应
5’
3’
5’
3’
3’
5’
GSP1
3’
GSP1
SUP
5’
5’
3’
5’
3’