文档介绍：转氨基作用与 氨基酸纸层析
咸宁学院医学院生化教研室
一、目的要求:
验证氨基酸的氨基移换作用
了解纸层析基本原理。
初步掌握利用纸层析法分离及鉴定氨基酸的技术(包括:点样、展层、显色等技术)。
二、实验原理:
1、转氨基作用:
Ala+α-***戊二酸***酸+Glu
ALT
层析法又称色谱法(Chromatography),是广泛应用的一种生物化学技术。层析法是利用混合物各组分物理化学性质(如溶解度、吸附能力、电荷和分子量等)的差别,使各组分在支持物上集中分布在不同区域,借此将各组分分离。
层析系统有两个相,一个相称为固定相;另一个相称为流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同,各组分移动速度各异,从而使各组得到分离。
流动相
液体
气体
方法名称
液相层析法(LC)
气相层析法(GC)
固定相
固体
液体
固体
液体
分离原理
吸附
分配
吸附
分配
方法名称
液-固层析法
(LSC)
液-液层析法
(LLC)
气-固层析法
(GSC)
气-液层析法
(GLC)
按两相所处的状态分类
按层析的原理分类:
吸附层析法
分配层析法
离子交换层析法
凝胶层析法
亲和层析法
按操作形式不同分类:
柱层析法
纸层析法
薄层层析法
薄膜层析法
纸层析:是利用混合物中各组分在二种不同溶剂中的分配系
数不同而使物质进行分离。
Kd=C2/C1
Kd:分配系数。分配系数大的物质在移动相中的移动速度则缓。
C1:物质在流动相中的浓度。
C2 :物质在固定相中的浓度。
固定相:水(滤纸上,6-7%)。
流动相:苯酚(正丁醇)。
溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示:
Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下,两相体积比是一常数,所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同,Rf值也不相同,由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。
点样点
A
B
C
溶剂展开方向
色斑中心至加样点中心的距离
溶剂前沿至加样点中心的距离
Rf
=
=
AB
AC
三:器材:匀浆器、试管、试管架、滤纸、剪刀
吹风机、层析缸、毛细管、喷雾器。
试剂:(1)
(2)
(3)-***戊二酸溶液
(4)
(5)%茚三***溶液
(6)层析溶剂
加入物(ml) 测定管空白管
肝匀浆
放置温度及时间 37℃ 10min 沸水浴 10min
mol/Lα-***戊二酸溶液
置37℃水浴中40min,保温完毕,立即将测定管放入沸水中10min以终止反应,取出冷却后。
四、实验操作:
1、肝匀浆的制备:肝2g,、
2、转氨基作用: