文档介绍：琼脂糖凝胶电泳检测DNA
电泳仪,电泳槽,紫外透射仪,凝胶成像仪,一次性塑料手套等
1、仪器设备
2、琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶液的制备:,置于三角瓶中,加入100ml TBE或TAE工作液,瓶口倒扣一个小烧杯,将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。
3、胶板的制备
取有机玻璃内槽,洗净、晾干;将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上,放好梳子。
将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液,小心地倒在有机玻璃内槽上,控制灌胶速度和量,使胶液缓慢地展开,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
室温下静置30min左右,待凝固完全后,轻轻拔出梳子,在胶板上即形成相互隔开的上样孔。-1×TAE(Tris-乙酸) 或TBE(Tris-硼酸)工作液的电泳槽中使用。
4、加样
用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品,换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部,本实验样品孔容量约15~20 l。
DNA Marker: 在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6l 的 1 kb DNA ladder(50ng/l ),或DL2000
5、电泳(带上手套操作)
加完样后的凝胶板即可通电进行电泳;
建议在80~100V的电压下电泳;
当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳;
将凝胶放入溴化乙啶(EB〕工作液(g/ml左右)中染色约20min。
为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不应高于5V/cm(两电极间的距离)。电泳温度视需要而定,对大分子的分离,以低温较好,也可在室温下进行。%时,由于胶太稀,最好在4℃进行电泳以增加凝胶硬度。
6、观察与拍照
在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右,肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时,应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩,避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时,可采用快速凝胶成象系统。
对于未进行酶切的质粒来说,常会出现两条电泳带,一条是(松弛)螺旋状质粒DNA带,另一条是超螺旋状质粒DNA的带,以超螺旋状质粒DNA居多,移动速度也最快。有时还会出现三条带,其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化,其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间,所以该条电泳带位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时,这条带会很弱,有时看不到。