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·448· 北京医学2023年第45卷第5期
·综述·
不同测序方法在病原微生物鉴定中应用的研究进展
陈翠珠
【摘要】快速准确的微生物鉴定有利于指导临床治疗用药和控制传染病流行。传统病原微生物鉴定耗时且应用
范围有限，越来越多测序方法被用于病原微生物研究。现从16S rRNA测序在细菌鉴定分析中的应用、18SrRNA和转录
间隔区序列(internallytranscribedspacersequences，ITss)在真菌或寄生虫等真核微生物鉴定分析中的应用、全基因组测
序(wholegenomesequencing，WGS)在可分离培养的单个微生物鉴定中的应用、宏基因组测序(metagenomicsequencing，
MGS)在未知感染的微生物检测中的应用进行综述，以期为病原微生物的鉴定方法提供参考。
【关键词】 病原微生物；16SrRNA；18SrRNA；全基因组；宏基因组测序；鉴定
基于测序原理用于病原微生物核酸检测的方法 择…。对于前500bp无法鉴定的菌株，则需要扩增全
主要有16SrRNA、18SrRNA和转录间隔区序列 序列，以获得完整的16SrRNA序列。16SrRNA部分
(internallytranscribedspacersequences，ITSs)、全基因扩增和全长扩增均可用于菌株鉴定和菌群分析，全长
组测序(wholegenomesequencing，WGS)、宏基因组测16SrRNA测序在鉴定细菌到种和株水平上的精度高
序(metagenomicsequencing，MGS)，其中16SrRNA是 于部分扩增‘2一l。
原核生物核糖体小亚基组成部分，是细菌特有序列， 2．16SrRNA测序的应用：16SrRNA测序用于非
用于细菌鉴定和分类分析；18SrRNA是真核生物核糖 培养菌群，分析步骤包括样品基因组DNA提取、PCR
体小亚基的组成部分，18SrRNA和ITS是真核生物特扩增、扩增产物测序、测序结果分析。常用于16SrRNA
有序列，用于真菌等具有真核结构的病原体分析。 数据分析的数据库有核糖体数据库项目(theribosome
16SrRNA／18SrRNA／ITS区序列分析可分为部分扩databaseproject，RDP)，SILVA核糖体RNA数据库
增子测序和全扩增子测序，部分扩增子测序通过PCR (SILVAribosomalRNAdatabase)和Greengenes数据库
方法分别扩增16S／18S，ITS的部分基因序列，分析目(thegreengenesdatabase)。16SrRNA测序分析软件包
的菌株片段；全扩增子测序将全长16S／18S／ITS扩增括微生物生态学定量研究(quantitativeinsightsinto
测序，对全序列进行分析。WGS分离单个菌株后，对 microbialecology，QIIME)和Mothur软件。l6SrRNA
其全长基因序列测定分析。MGS不需分离单个微生 测序用于胃肠道微生物检测H弓·，对幽门螺杆菌阴性的
物，可同时测定多种类型微生物，包括细菌、真菌、病 胃癌分期患者进行的胃黏膜及胃液微生物分析结果
毒等。现从16SrRNA测序在细菌鉴定分析中的应 显示，胃癌不同进展阶段的胃黏膜微生物群存在差
用、18SrRNA和ITS测序在真菌或寄生虫等真核微生异，与胃癌进展程度相关，提示胃黏膜微生物群的差
物鉴定分析中的应用、WGS在可分离培养的单个微生 异性可作为胃癌进展诊断标记物。16SrRNA测序可
物鉴定中的应用、MGS在未知感染的微生物检测中的 用于糖尿病足骨髓炎的病原微生物分析161等。
应用综述如下。 3．16SrRNA测序的优缺点：16SrRNA扩增子测
一、16SrRNA测序在细菌鉴定分析中的应用 序优点包括：①每次扩增对象单一，减少了测序量、测
1．16SrRNA的结构特点：16SrRNA存在于所有 序时间和成本；②对测序分析软件的要求比MGS低；
细菌，其核苷酸数目约l 540bp，包含9个可变区和 ③测序操作简单、价格低廉，其宿主污染、假阳性比例
10个保守区。16SrRNA前500bp序列变化较大，包 低，适用于细菌发育过程中标记物的研究。缺点包
含细菌种属的特异性信息。对于大多数菌株来说只 括：①只能用于细菌的鉴定及分类学分析，如果仅仅
需要扩增前500bp的序列，即可鉴定出细菌的菌属。 扩增某个可变区或恒定区，由于引物对不同扩增产物
目前，16SrRNAV3一V4区测序是菌种分析的最佳选 不同，对菌株的预测会产生偏差171；②没有一个区域可
作者单位：100730中国医学科学院北京协和医学院北京协和医 以扩增后鉴定所有菌株；③只能检测到属水平及以
院医学科学研究中心疑难重症及罕见病国家重点实验室
通信作者：陈翠珠，Email：******@163．corn 上，不适用于更精细的分类；④由于只扩增基因部分
DOhlO．159320．0253-9713．2023．05．017 序列，很难对基因功能进行预测IsJ。
万方数据 : .
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二、18SrRNA和ITS区测序在真菌或寄生虫等真应用于各种微生物的测序识别及功能分析。一项采
核微生物鉴定分析中的应用 用WGS对德国境内发生的22次食源性李斯特菌暴发
1．18SrRNA和ITS的结构特点：真菌核糖体基因流行引起的感染甚至死亡事件进行的回溯性研究结
按5’一3’方向依次为：18SrRNA、ITSl区、5．8SrRNA、 果显示，感染原因为熏制三文鱼且引起的感染可引起
ITS2区和28SrRNA。18SrRNA既有保守区，也有可 跨境传播”01。WGS还可用于分析病原体的毒力因子、
变区(v卜v9，没有v6区)，其中V4区数据库信息最耐药基因及菌株的演变流行等““。
全，常用于真菌等真核生物种级及以上的分类学研 2．WGS的优缺点：WGS的优点包括：①包含微生
究“I。ITS序列是内源转录间隔区，分为ITSl和ITS2。物的全部遗传信息，除分类信息外还有更多的基因信
2．18SrRNA和ITS测序的应用及优缺点：在真菌息，可检测多种基因变异类型；②能够检测到全基因
中，18s、5．8S、28SrRNA基因序列进化缓慢且相对保 组范围的单核苷酸多态性(singlenucleotide
守，18S可用于构建远距离的系统发育关系，但对于鉴 polymorphism，SNP)信息，包括低频SNP；③可发现特
定物种或区分种内株系比较困难；这3个基因序列之 定情况下富集的功能基因；④可检测新的变异序列，
间的ITS序列进化相当迅速，在绝大多数真菌中表现 并鉴定新的微生物(可分离培养但无法通过常规生化
出广泛的序列多态性。ITS的保守型表现为种内相对 方法鉴定的微生物)。缺点包括：①相对靶基因测序，
一致，种间差异较明显，能够反映种属间、甚至菌株间 WGS测序深度低，冗余信息多；②成本高、计算机要求
的差异。因此，ITS可用来鉴定特定的物种和株系，不 高、数据分析难度高。
适用于构建远距离的系统发育关系。目前普遍做法 四、MGS在未知感染微生物检测中的应用
是将18S和ITS结合，以较好地分析进化，又能获得高 1．MGS的定义：宏基因组(metagenomics)也称元
物种分辨率。一项了解蛇蝇能够作为中间宿主传播 基因组，最早用于环境微生物研究，将来自环境中所
锥虫病给其他哺乳动物的研究采用了PCR扩增测序 有微生物基因集在某种程度上当成一个整体基因组
方法检测18SrRNA、ITS和12SrRNA(哺乳动物特有 的研究分析，现已逐渐用于其他领域。MGS以特定环
序列)，分析蛇蝇体内吸食的血液来源和体内存在的 境中细菌、真菌、病毒、寄生虫等全部微生物作为研究
真核寄生虫种类，结果显示包括人类在内的很多哺乳 对象，应用现代基因组学技术直接在自然状态下研究
动物都是蛇蝇的吸血来源；18SrRNA基因深度测序显 微生物组群落，不需要在实验室中分离培养单一菌
示，有6个蛇蝇样本携带锥虫基因，后续ITSl基因测 株””。由于很多微生物无法通过实验室条件培养，
序将其鉴定为戈弗雷锥虫和猴锥虫191。18SrRNA和 MGS极大提高了微生物的检出率。
ITS测序优点包括操作简单、价格低廉、宿主污染和假 2．MGS的步骤及优缺点：MGS的步骤主要包括样
阳性比例低、测序分析软件对人员要求低等，缺点包 本采集、样本前处理、核酸提取及质量分析、扩增建库
括分析精度低、分析内容有限等。 和测序、数据分析、报告解读。与传统微生物研究方
三、WGS在可分离培养单个微生物鉴定中的应用 法相比，MGS优点包括通量高、不需要培养、可检测痕
1．WGS的应用：微生物WGS指通过基因组测序 量微生物、能够鉴定单一菌种到种和株水平、分类鉴
和组装获得某种微生物全基因组序列，并对其进行结 定覆盖广、能够更精确的预测基因功能等。缺点包括
构和功能研究的方法。WGS通过序列比对，可以检测 操作复杂、对操作人员要求高、价格昂贵、宿主基因组
包括单核苷酸多态性、碱基插人缺失突变、基因结构 影响大、假阳性高、数据分析要求高、没有统一的参比
变异等大量突变信息。其检测到的序列改变能进一 数据库等。
步发现微生物的功能改变、种属演变及群体进化问 3．MGS的应用：MGS用于微生物研究的方向主要
题。WGS检测对象包括纯菌株、菌落平板或者菌液。 包括：①病原微生物爆发、传播、溯源和致病性研
检测平台包括二代高通量测序平台和三代高通量测 究n…，院内感染病原体存在于病床栏杆、灯的开关、电
序平台。WGS分析常用的数据库包括参比序列数据 话按键、医院管道等各处，并可通过医护人员以及拜
库(referencesequence，refseq)和DNA序列数据库访者进行传播，采用MGS可筛选病原体种类并溯源，
GenBank，小一点聚焦病原体的数据库有病原体系统早期预防可防止传播；②慢性感染疾病病因学诊
资源整合中心(pathosystemsresourceintegration断”…，中枢神经系统感染疾病诊断I-”，呼吸系统感染诊
center，PATRIC)和真核生物病原体数据库(the断，包括新型冠状病毒感染诊断n酬、不明原因发热及
eukaryoticpathogendatabase，EuPathDB)。WGS广泛新发病原体诊断n71；③营养和代谢研究1181；④皮肤健康
万方数据 : .
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与疾病研究“9】；⑤婴儿不同出生方式及不同出生环境 踟 DurazziF，SalaC，CastellaniG，eta1．Comparisonbetween16S
rRNA and shotgunsequencingdataforthetaxonomic
下体内菌群构成的研究口o】；⑥微生物与肿瘤相关性研
characterizationofthegutmicrobiota[J]．SciRep，2021，1h3030．
究【2ll；⑦新药研发中的应用等mI。 卿 KimJY，ChoiJH，NamSH，eta1．Parasitesandblood-mealhostsof
五、展望与小结 thetsetseflyinTanzania：ametagenomicsstudy[J]．ParasitVectors，
不同方法具有不同的适用条件，根据需求选择最 2022，15：224．
m LachmannR，HalbedelS，LiithS，eta1．1nvasivelisteriosisoutbreaks
合适的方法，以期达到最佳效果。伴随测序成本的降
andsalmonproducts：agenomic，epidemiologicalstudy[J]．Emerg
低和测序方法的不断改进，以上测序方法在临床上的 MicrobesInfect，2022，11：1308—1315．
应用前景将会更加宽广。 ¨ YangX，SunQ，LiJ，eta1．Molecularepidemiologyofcarbapenem—
综上所述，16SrRNA／18SrRNA／ITS区测序可分 resistanthypervirulentKlebsiellapneumoniaeinChina[J]．Emerg
MicrobesInfect，2022，11：841—849．
为部分扩增子测序和全扩增子测序，既可用于培养菌 忱 L．Bioinformaticsfor
ChenK，Paehter whole—genomeshotgun
株的鉴定，又可用于非培养菌群的结构分析和进化过 sequencingofmicrobialcommunities[J]．PlosComputBiol，2005，l：
程中的标记物研究，部分扩增子测序在用于靶向鉴定 106一112．
某种菌株时，操作简单、易于分析；全扩增子测序精度 ” XuY，LewandowskiK，DownsLO，etal，Nanoporemetagenomic
sequencingofinfluenzavirusdirectlyfromrespiratorysamples：
高于部分扩增子，可鉴定菌株到种和株水平，但在基 resistanceandnosocomial
diagnosis，drug transmission，united
因功能的预测方面具有局限性；WGS主要用于单一、 kingdom，2018119influenzaseason[J]．EuroSurveill，2021，26：
可分离培养的未知菌株的鉴定和功能分析，并可用于 2000004．
菌株的进化分析和流行性分析；MGS主要用于新发未 H LiuY，TeoSM，MericG，eta1．Thegutmicrobiomeisasignificant
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知病原体的检测、溯源、流行性分析，还可用于临床中
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反复慢性感染，危重症等常规微生物检测方法无法检 ：2 LiaoH，ZhangY，GuoW，eta1．Characterizationofthebloodand
测到病原体的鉴定；在基因功能预测上，DNAWGS／MGS cerebrospinalfluidmicrobiomeinchildrenwithbacterialmeningitis
能够预测可能的功能基因序列，而RNAWGS／MGS anditspotentialcorrelationwithinflammation[J]．mSystems，2021，6：
e00004921．
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