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重要内容
一、Western Blot 技术原理与试验流程
二、Western Blot 技术常见问题分析
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Western Blot定义
Western Blot又称免疫印迹，重要是通过电泳将样品中的不一样蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，运用对应的抗体来检测目的蛋白的一种措施。
Western Blot 应用目的：
检测样品中特异性蛋白质的存在
细胞中某种蛋白质的半定量分析
蛋白质分子的互相作用研究
Western Blot试验流程
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Step4 转膜
Step6 免疫反应
Step7 检测
Step2 蛋白定量
Step3 SDS-PAGE
Step1 蛋白提取
Step5 封闭
确定蛋白位置，选择合适的蛋白抽提试剂
防止蛋白质的降解
冰上操作
加入蛋白酶克制剂
Bac-细菌蛋白抽提试剂
Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂
Yea-酵母蛋白抽提试剂
Tis-组织蛋白抽提试剂
Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂
环节一、蛋白提取
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环节二、蛋白定量
Bradford
检测范围：100-1,500 ug/ml
BCA
检测范围：20-2,000 ug/ml
Lowry
检测范围： 1－1500ug/ml
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BCA定量
在562nm处有高的光吸取值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。
绘制原则曲线，计算样品中的蛋白浓度。
梯度稀释
环节三、SDS-PAGE 电泳
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上样前煮沸样品
上样量：30-100 μg
蛋白Marker
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环节四、转膜
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膜的选择：
NC、PVDF、尼龙膜
转膜措施：
半干转、湿转
转膜确认：
立春红染色、蛋白预染Marker
膜的选择
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