PCR仪和凝胶成像系统.ppt

文档介绍：PCR仪和凝胶成像系统
仪器分析实验——分子生物学实验技术
药学院:刘明华
内容
PCR的反应原理及反应体系
PCR示例
凝胶成像系统
多聚酶链式反应
(PCR:Polymerase Chain Reaction)
Kary B. Mullis
PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种在体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法,此技术获得1993年诺贝尔化学奖。
体内DNA的复制体系
DNA聚合酶(I II III)
拓扑异构酶
解旋酶类
SSB
引物
dNTP Mg2+
5’
3’
模板
Mullis的PCR构思
引物
引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
特定DN***段
模板
Mg2+
dNTP
Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)
酶活性(%)
温度(℃)
40 50 60 70 80 90 100
100
80
60
40
20
此酶的发现, 被PCR广泛应用。在 1989 年,Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命名为当年的风云分子  (Molecule of the year)
酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。
反应体系中:- U/50 l
耐高温
Taq
P1
P2
PCR反应体系
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
Mg2+
模板:DNA
引物:P1 P2
DNA聚合酶:Taq
原料:dNTP
辅助因子:Mg2+
五要素
反应条件
PCR反应条件
72℃
94℃
55℃
PCR循环
变性
退火
延伸
温度三点法
温度、时间和循环次数。
PCR反应条件
变性
使双链DNA解链为单链
94℃, 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;
降低温度可增加反应的灵敏性。
一般为45~65℃, 30秒
PCR仪