文档介绍：第三章
基因的克隆方法
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前言
基因是生物染色体上的一段DNA序列,具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。
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基因的表达过程
mRNA
翻译成蛋白质
基因组DNA
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如何获得基因?
——即基因的克隆方法
基于基因产物的基因克隆方法
基于基因加标签的基因克隆方法
基于基因序列的基因克隆方法
基于基因图谱的基因克隆方法
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一、基于基因产物的基因克隆方法
mRNA
翻译成蛋白质
1、根据蛋白质序列克隆目的基因
2、根据基因表达差异(mRNA)克隆基因
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实用性:
分离纯化蛋白质十分困难
Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile
TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA
C T GATG G G T T
C
据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列
注意!
密码子有简并性现象!
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2、根据基因表达差异(mRNA)克隆基因
基因表达的差异表现:
一是基因表达的种类的不同;
二是基因表达水平的改变。
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差减杂交(SH)
抑制性差减杂交(SSH)
差异显示PCR(DD RT-PCR)
DNA代表性差异分析(DNA RDA)
扩增限制性片段长度多样性(AFLP)
cDNA微阵列
已发展的相应基因克隆方法:
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差减杂交(SH)
最早由Lamar和Palmer于1984年提出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究。
超声波打断雌鼠的DNA(过量100倍)(XX)
MboI完全消化雄鼠的DNA (XY)
变性、复性
去除共有序列
BamHI酶切表达载体
连接、转化、测序分析
缺点:技术要求高,耗时,工作量大