文档介绍：第三章基因的克隆方法 2前言前言基因是生物染色体上的一段 DNA 序列,具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。 3 3基因的表达过程基因的表达过程 mRNA mRNA 翻译成翻译成蛋白质蛋白质基因组基因组 DNA DNA 4 如何获得基因? 如何获得基因? ——即基因的克隆方法?基于基因产物的基因克隆方法?基于基因加标签的基因克隆方法?基于基因序列的基因克隆方法?基于基因图谱的基因克隆方法 5一、一、基于基因产物的基因克隆方法基于基因产物的基因克隆方法 mRNA mRNA 翻译成翻译成蛋白质蛋白质 1、根据蛋白质序列克隆目的基因 2、根据基因表达差异( mRNA )克隆基因 6原理:根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列,反推核苷酸序列, 然后设计探针或引物从基因组文库或cDNA 文库中分离出相应的基因。 1 1、蛋白质序列克隆法、蛋白质序列克隆法 7 实用性: 分离纯化蛋白质十分困难 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile TGT ATG GAC GAA ATG AAA AGA AAC ATA TGT ATG GAC GAA ATG AAA AGA AAC ATA CTGATG GGTT CTGATG GGTTC C 据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列注意! 密码子有简并性现象! 8 2、根据基因表达差异( mRNA )克隆基因基因表达的差异表现: ?一是基因表达的种类的不同; ?二是基因表达水平的改变。 9?差减杂交( SH) ?抑制性差减杂交(SSH ) ?差异显示 PCR (DD RT-PCR ) ?DNA 代表性差异分析(DNA RDA ) ?扩增限制性片段长度多样性( AFLP ) ?cDNA 微阵列已发展的相应基因克隆方法: 已发展的相应基因克隆方法: 10 ?差减杂交( 差减杂交( SH SH) ) ?最早由 Lamar 和 Palmer 于 1984 年提出并用于雄鼠 Y染色体的 DNA 研究。超声波打断雌鼠的 DNA (过量 100 倍) (XX) MboI 完全消化雄鼠的 DNA (XY) 变性、复性去除共有序列 BamHI 酶切表达载体连接、转化、测序分析缺点:技术要求高,耗时,工作量大