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刘吴娟;陈青;郭金;龙云川;冯焕鹏;王嫱;李祝
【摘 要】对黑曲霉(Aspergillus niger xj)抗菌活性进展争论以筛选自然抗菌药物. 利用 PDA 液体发酵培育黑曲霉,菌丝体用 90％乙醇加热回流提取,减压回收溶剂得浸膏,浸膏用水分散,依次用石油醚和醋酸乙酯萃取,分别回收溶剂得到石油醚、醋酸
,分别回收溶剂得到石油醚、, 在供试浓度为 50 mg/mL、指示菌为金黄色葡萄球菌的检测条件下,发酵液醋酸乙
酯局部具有明显的抗菌活性,菌丝体及发酵液石油醚局部的抗菌活性相对较弱,其余粗提物未检测到抗菌活性.
【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】2025(039)002
【总页数】3 页(P76-78)
【关键词】黑曲霉;菌丝体;发酵液;抗菌活性
【作 者】刘吴娟;陈青;郭金;龙云川;冯焕鹏;王嫱;李祝
【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025;贵州大学化学与化工学院, 贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025;贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025
【正文语种】中 文
【中图分类】
自青霉素问世以来，在很长一段时间内抗生素是掌握和治疗金黄色葡萄球菌的有效手段[1]。然而，随着抗生素的大量使用和耐药性菌株的不断消灭，可以确定，出 现对全部抗生素完全耐受的金黄色葡萄球菌，即超级细菌，将只是时间长短的问题[2]。因此争论和开发型的抗金黄色葡萄球菌药物成为了亟待解决的问题。目前，
世界各国制药公司和争论机构都格外重视从自然产物中筛选和觉察的先导化合物， 再进展化学构造修饰，以研制的抗感染药物[3]，其中微生物药物又是各国研制
药的一个重要源泉[4]。
黑曲霉〔Aspergillus niger〕是公认安全的微生物，具有多种活性强大的酶系[5- 6]。美国 FDA 准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约 20 种，其中以黑曲霉所产酶类最多[7]。黑曲霉酶类在工业上的作用已愈来愈受到人们的重视，但将黑曲霉运用在抗菌药物争论与开发的报道甚少。在国内， Song 等[8]从黑曲霉发酵产物中分得的 4 种 γ-萘-吡喃酮类化合物具抗细菌及真菌活性；李祝等[9-10]分别到一株 Aspergillus niger xj 对根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens 及 Staphylococcus aureus 具有抑制作用。在国外，Yoko 等[11]从 Aspergillus niger FKI-2342 发酵液中分别的 6 种化合物中只有 tensyuic acid C 对 Bacillus subtilis 显示了肯定的抗菌活性。
本争论以黑曲霉〔Aspergillus niger xj〕为争论对象，通过发酵罐液体发酵，分别对发酵产物菌丝体及发酵液依次用石油醚和醋酸乙酯萃取，对得到的 7 种粗提
物进展抗菌活性初步筛选，以期为黑曲霉在抗菌药物方面的开发利用供给理论依据， 且为后续黑曲霉抗菌活性代谢产物的分别纯化争论奠定肯定根底。
材料与方法
试验材料
菌株 黑曲霉由贵州大学真菌资源争论所分别，保藏于中国典型培育物保藏
中心，CCTCCNO：M206021。金黄色葡萄球菌〔Staphylococcus aureus〕保存于贵州大学生命科学学院微生物试验室。
培育基 PDA 培育基：马铃薯 200 g 切块，用水煮沸 30 min，纱布过滤， 收集滤液加葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，水补足 1 000 mL，pH 自然。灭菌条件为121℃、30 min〔以下灭菌条件与此一样〕。PDA 液体培育基：配方同上，未加琼脂。牛肉膏蛋白胨培育基：牛肉膏 g/L，蛋白胨 g/L，NaCl g/L， 琼脂 15～20 g，水 1 000 mL，pH ～。
主要试剂 无水乙醇、醋酸乙酯、石油醚为分析纯，购自上海化学试剂总厂和重庆川东化工集团；柱层析硅胶 G，青岛海洋化工分厂产品。
仪器设备 HPMS5973 质谱仪，美国 HP 公司；R-201-B-II 型旋转蒸发仪， 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-3 型循环真空水泵，上海亚荣生化仪器厂；SW-CJ- IBV 型无菌工作台，苏州安泰技术。
试验方法
菌丝体及发酵液的获得 将黑曲霉菌株接种于 PDA 固体斜面，27℃培育 3～ 4 d，活化 2～3 代。挑取生长良好的活化菌株斜面，接入 100 mL PDA 液体培育基中，27℃、150 r/min 条件下，培育 3 d 作为种子液备用。按 10%(V/V)的比例将种子液转接到 13 L PDA 液体培育基中，在 28〔±1〕℃、搅拌速度 200～300 r/min、通气量 1～2 L/min 条件下，通过添加豆油消泡，培育 5 d 终止发酵。4 层无菌纱布过滤收集发酵液和菌丝体。发酵液 4℃下保存备用，菌丝体于减压真空枯燥箱中 50℃烘至恒重，研磨成粉，备用。
供试样品的制备 将黑曲霉菌丝体 234 g 用 90%乙醇加热回流提取 3 次〔3、2、1 h〕，乙醇用量依次为 700、300、300 mL，合并 3 次醇提液，过滤，减压
回收乙醇得到醇提物浸膏 39 g，将浸膏加适当水分散后，依次用石油醚和醋酸乙
酯萃取，减压回收溶剂，得到供试样品石油醚、醋酸乙酯和水局部。黑曲霉发酵液
直接用石油醚和醋酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得供试样品石油醚、醋酸乙酯和水局部。
指示菌平板的制备 取在牛肉膏蛋白胨上培育好的金黄色葡萄球菌斜面菌株 1 支，注入无菌水 5 mL，用移液枪轻轻吹打并充分混匀，制成细菌密度为 106～ 107 个/mL 的菌悬液。吸取 200 μL 菌悬液注入平皿中，并倒入 45～50℃的牛肉膏蛋白胨培育基充分混匀。
抗菌活性测定 以金黄色葡萄球菌为指示菌，承受滤纸片集中法[12]对对黑曲霉菌丝体及发酵液各粗提物进展抗菌活性的测定，活性大小以抑菌圈直径(mm)表示。取适量待测样品，用微量 DMSO 助溶后，用无菌水配成浓度为 50 mg/mL 的溶液，以不加样品〔等体积的相应溶媒〕为比照。将待测样品在紫外光下照耀30 min，吸取 20 μL 于无菌圆滤纸片(直径 6 mm)上，在酒精灯前略微枯燥，轻轻放在指示菌平板上，37℃培育 36 h，观看并测定抑菌圈大小，用十字叉法测量抑菌圈直径，取平均值为试验结果。以上步骤均按无菌要求操作，每个样品设两个平行，3 个重复。
全部数据利用 统计分析软件分析处理。2 结果与分析
黑曲霉发酵培育结果
黑曲霉经斜面活化后表现为菌丝粗大，产生大量黑色分生孢子布满整个斜面，将其接种于液体种子培育基上培育 3 d 后，观看到菌丝严密纠缠形成菌丝球，均匀地悬浮在培育液中。这可能有利于氧的传递及养分物的输送，可促进菌丝的生长和代谢产物的生成。液体母种中的菌丝球经肉眼观看：细小且均匀，呈奶黄色，有淡淡的香味；显微镜观看：具有致密的网状构造，无空胞消灭。这时将液体母种转接于发酵罐培育基进展培育。发酵罐培育过程中观看到菌丝形态大局部形成较松散的菌
丝团。这可能是由于黑曲霉是一种丝状真菌，带有搅拌器的发酵罐对其产生较大的
剪切力作用，导致菌丝断裂，无法形成摇瓶发酵中消灭的严密缠绕的菌丝球。发酵5 d 时，培育液里布满浅黄色菌丝团，培育液变成浅黄色粘稠状，此时完毕发酵。
菌丝体及发酵液粗提物抗菌活性
按试验方法处理收集到的黑曲霉菌丝粉及发酵液，共获得 7 种相应的粗提物，分别为菌丝体的醇提物局部、石油醚局部、醋酸乙酯局部、水局部及发酵液的石油醚局部、醋酸乙酯局部、水局部。7 种不同粗提物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性见表1 和图 1。结果说明，样品浓度为 50 mg/mL 时，发酵液醋酸乙酯局部具有明显的抑菌活性，菌丝体及发酵液的石油醚局部抑菌活性相对较弱，且前者抑菌效果强于后者，其他提取物无抗菌活性。
表 1 黑曲霉菌丝体及发酵液各粗提物抗菌活性测定结果注：“-”表示没有抗菌活性。处理菌丝体抑菌圈直径(mm)-±--发酵液 ± ± 比照粗提物醇提物石油醚局部醋酸乙酯局部水局部石油醚局部醋酸乙酯局部水局部溶媒--
3 结语
本争论从抗菌活性方面证明，黑曲霉发酵液醋酸乙酯局部在浓度为 50 mg/mL 时， 对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有较为明显的抑制作用，菌丝体及发酵液石油醚 局部的抗菌活性相对较弱。因此可确定黑曲霉菌丝体和发酵液中都具有次生代谢的 自然抗菌活性物质。然而黑曲霉其他提取物未检测到抗菌活性，这可能是由于本研 究中用于检测抗菌活性的供试菌株仅为金黄色葡萄球菌，筛选菌株单一的缘由。
图 2 黑曲霉菌丝体及发酵液各粗提物抑制作用A：发酵液醋酸乙酯局部的抑制作用；B：发酵液石油醚局部的抑制作用；C：菌丝体石油醚局部的抑制作用
发酵液的醋酸乙酯局部表现出较强的抗菌活性，与此对应的精准活性物质还有待进一步争论确定。这不仅有助于了解黑曲霉抑菌活性的本质，也将为药物的筛选供给
更多的先导化合物。本次争论确定了黑曲霉抗菌活性部位为菌丝体的石油醚局部及
发酵液的醋酸乙酯和石油醚局部，其中发酵液醋酸乙酯局部的抗菌作用明显，说明黑曲霉具有产生自然抗菌活性物质的潜在价值，可以为型抗感染药物的筛选供给的资源。
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