文档介绍：生化实验报告实验实验-考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的含量(p24)一、冃的要求掌握考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质含量原理和方法。二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质一染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质通过范德华键结合后,变为蓝色。在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰(Imax)的位置,由465nm变为595nm0且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是:(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达lmg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质一染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、疏基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是:(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、TritonX-100>十二烷基硫酸钠(SDS)等。三、材料、试剂与器具(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇,加入100ml85%H3PO4,用蒸馅水稀释至1000ml,滤纸过滤。%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4-7%(W/V)乙醇,%(W/V)H3PO402、标准蛋白质溶液:纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,。(二),预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,。2•待测蛋白质溶液。人血清,。(二)、器材:1、(x6)和试管架。2、(x2);ImL(x2);5mL(xl);3、可见光分光光度计。(三)、标准曲线制作:2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(),在坐标轴上绘制标准曲线。1)利用标准曲线查出回归方程。2)用公式计算回归方程。,至少2个9以上。4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。(四)、蛋白质含量的测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样晶蛋白质含量。—,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。2、取量要准确。3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。4、对照:用被测物质以外的物质作空白对照。5、在试剂加入后的5-20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。6、测定中,蛋白一染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。实验二、紫外吸收法测定核酸的含量一、目的1、熟悉紫外分光光度计的基木原理和使用方法。2、学****紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。二、原理核酸、核昔酸及其衍生物的分子结构中的瞟吟、卩密喘碱基具有共轨双健系统(一C=C一C=C一),能够强烈吸收250〜280nm波长的紫外光。核酸(DNA,RNA)的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律,可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。试管编号012345未知200ug/ml标准蛋白(ml)(ml)(ml)666666摇匀,lh内以1