文档介绍：实验七 P94 聚丙烯酰***、 SDS -聚丙烯酰***凝胶垂直板电泳 PAGE SDS-PAGE
一、目的要求
-聚丙烯酰***凝胶垂直板电泳技术
二、原理
聚丙烯酰***凝胶是由单体丙烯酰***(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰***(Bis)在加速剂N,N,N,N—四***乙二***(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰***凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)。
聚丙烯酰***凝胶有下列特性:
(1)在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好;
(2)化学性能稳定,与被分离物不起化学反应,在很多溶剂中不溶;
(3)对pH和温度变化较稳定;
(4)几乎无吸附和电渗作用,只要Acr纯度高,操作条件一致,则样品分离重复性好;
(5)样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g
(6)凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径;
(7)分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围适用的凝胶浓度/(%)
蛋白质
104 20-30
1-4×104 15-20
1-5×104-1×105 10-15
1×105 5-10
5×105 2-5
核酸(RNA)
104 15–20
104–105 5-10
105-2×106 2-
聚丙烯酰***凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
目前常用的多为板状电泳(如图)
图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图
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不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,-HC1。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶, Tris-HC1。 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。
(1)样品浓缩效应
(a)凝胶孔径不连续性:
(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性;
前导离子或快离子:HC1解离出的***根(C1-)
尾随离子(trailing ion)或慢离子:甘氨酸根
,甘氨酸解离度增加,其有效迁移率超过蛋白质;
(c)电位梯度的不连续性:
(2)分子筛效应
(3)电荷效应
A为电泳前3层凝胶排列顺序,3层胶中均有快离子,慢离子 B显示电泳开始后,蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。
电泳过程示意图