谷丙转氨酶(ALTGPT)测定程序(赖氏法).doc

文档介绍：谷丙转氨酶测定程序(赖氏法)
原理与意义:
谷丙转氨酶(ALT/GPT)在37℃,作用于丙氨酸及ɑ-***戊二酸组成的底物,生成***酸及谷氨酸。反应30 min后(固定时间)加入2,4-二硝基苯肼(DNPH)盐酸溶液,即中止反应,同时DNPH与***酸中羰基加成,生成***酸苯腙。苯腙在碱性条件下呈红棕色,于505 nm测定吸光值并计算酶活力。根据ALT活力的高低来反映肝脏细胞损伤的程度。
二、试剂及其配制:
谷丙转氨酶基质液:4 ℃冰箱保存。
2,4-二硝基苯肼(DNPH)液:室温避光保存。
4 mol/LNaOH: mol/L,室温保存。
2 mmol/ml***酸钠标准液,室温保存。
mol/L磷酸盐缓冲液,4 ℃冰箱保存。
三、仪器设备:
离心机、7 ml离心管、移液器、分光光度计、玻璃比色杯、水浴锅、玻璃棒、冰箱、烧杯、量筒等。
四、操作步骤:
1、血清制备:
采集全血,室温放置1~2 h,3000 r×15 min离心取上清,待测。
2、血清ALT的测定:
表1 血清ALT的测定加样顺序(ml)
测定管
对照管
血清

基质液(37 ℃已预热5 min)


混匀后,37 ℃水浴30 min
2,4-二硝基苯肼液


血清

混匀后,37 ℃水浴20 min
mol/L NaOH
5
5
混匀,室温放置5 min,505 nm波长,蒸馏水调零,测各管吸光度,测定管吸光度减去对照管吸光度的差值,查标准曲线,求得相应ALT/GPT活力单位。
五、结果计算与评价
表2 标准曲线加样顺序
0
1
2
3
4
5
(ml)






2µmol/ml***酸钠标准液(ml)
0





谷丙转氨酶基质液(ml)






2,4-二硝基苯肼液(ml)






混匀后,37 ℃水浴20 min
mol/L NaOH
5
5
混匀,室温放置10 min,505 nm波长,蒸馏水调零,测各管吸光度,各管吸光度减去零管吸光度的差值为纵坐标,相应的卡门氏单位为横坐标,作坐标