文档介绍：实验一
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
杨受保
绍兴文理学院生科院
******@zscas.
一. 目的和要求
学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细
胞和将外源质粒DNA转入受体菌细胞的
技术及转化体筛选的技术方法。
二. 实验原理
petent cells):
受体细胞经过一些特殊方法(如:
CaCl2,RuCl等化学试剂法)的处理后,
细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多
有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞
(competent cell) 。
转化(transformation):
是将异源DNA分子引入受体细胞,使其获得
新的遗传性状的一种技术方法。
进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实
现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传
性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制-修
饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和
甲基化酶的突变株。
转化的方法:
1. 化学的方法(热击法);使用化学试剂(如
CaCl)制备的感受态细胞,通过热击处
理将载体DNA分子导入受体细胞;
2. 电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的
感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
克隆的筛选:
主要用不同抗生素基因筛选。常用的
抗生素有:氨苄青霉素、卡那霉素、
氯霉素、四环素、链霉素等;
、材料和试剂
无菌超净台,离心机
电热恒温水浴,分光光度计
移液器,微型离心管等
菌株: DH5α
质粒:PUC19质粒
LB培养基
含抗菌素的LB平板培养基(氨苄青霉素,浓度
50-100µg/ml
预冷CaCl2溶液()

(一)感受态大肠杆菌的制备
1. DH5α菌平板上挑取一单菌
落,接种于25ml LB液体培养中,37℃振荡培
养12h左右,直至对数生长期。
2. LB液体培养基中,
37℃振荡扩大培养2-3h(OD600nm≤ ,
细胞数<108);
3. ,冰上冷却
10min,于4℃,4000r/min离心5min;
4. 倒净上清培养液,
CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰浴30min;
5. 0~4℃,4000r/min离心10min;
6. 弃上清, CaCl2溶
液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻后,即制
成了感受态细胞悬液。
7. 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实
验,也可加入占总体积15%左右高压灭菌过的
甘油,,置于-
70℃条件下,可保存半年至一年。