质粒提取和PCR样品纯化.ppt

文档介绍：质粒提取和PCR样品纯化
王忠杰
2017/11/12
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质粒的提取(D/E/F)
PCR样品的处理(A/B/C)
2017/11/12
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细菌生长各阶段的特点
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两种培养基的比较
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质粒提取(碱裂解法)
此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、测序分析。
由于操作原因,提取的质粒可有三种结构:复性中间体、开环、闭环超螺旋。
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质粒提取的思路
三个基本步骤:
细菌的生长
菌体的收集裂解及质粒DNA的分离
质粒DNA的纯化
要去除的物质:
蛋白
基因组DNA
脂类及小分子杂质
RNA
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溶液 I
葡萄糖
Tris·Cl ()
EDTA ()
高压下蒸汽灭菌15分钟,保存于4℃。
加入RNase。
作用:调节菌体细胞渗透压,分散菌体,给予溶液II
更大的作用空间。鳌合金属离子。
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溶液 II
NaOH
SDS
作用:裂解菌体,使核酸和蛋白质变性。
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溶液 III
乙酸钾
乙酸
作用:中和溶液II,质粒DNA复性,变性蛋白-SDS-基
因组DNA-K盐的溶解度比其Na盐更低,有利于蛋白混合
物的沉淀。
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质粒提取操作流程
接菌

振荡培养过夜

离心,收集菌体

溶液I悬浮菌体(充分振荡)

加入溶液II(涡旋振荡)

加入溶液III(涡旋振荡)
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