文档介绍：实验一鲜叶蛋白提取及SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰***凝胶电泳),简称SDS电泳。它不需要昂贵的仪器设备,操作简便,能在几小时内得到结果,有较高的重复性,且不要非常纯的样品(取决于样品的组成和对结果的要求),是目前为大家所接受的用于测定亚基分子质量的一种最好方法。这个方法可用于多肽分子量的分析,用于变性蛋白的分离以及仅仅溶解在粒子去污剂中的膜蛋白和用层析方法分离的蛋白和酶的纯化控制。
1 材料与试剂

茶树鲜叶(Camellia sinensis (L.) O. cultivar Shuchazao)采自安徽农业大学试验茶园。

丙烯酰***/甲叉双丙烯酰***溶液(%):将300g丙烯酰***和8g甲叉双丙烯酰***溶解于去离子水中,最后用去离子水将体积定溶到1000ml。过滤后可在4℃保存两周。
分离胶缓冲液: mol/L Tris-HCL, ( Tris溶于200ml去离子水中,用浓 ,最后用去离子水将体积补足到250ml。此溶液在4℃可保存两周。)
浓缩胶缓冲液: mol/L Tris-HCL ,pH ,( Tris溶于200ml去离子水中,用浓 ,最后用去离子水将体积补足到250ml。(此溶液在4℃可保存两周。)
10Χ电极缓冲液( Tris, mol/L 甘氨酸,1% SDS): Tris,, SDS溶于500ml去离子水中,临用时稀释10倍。
10%过硫酸铵溶液:1g过硫酸铵溶于10ml去离子水中,使用前现配现用。
95%乙醇(在灌制分离胶后,用于封胶,使胶面平整)
10%SDS:10gSDS溶于100ml去离子水中。
10%低熔点琼脂糖溶液:。
蛋白提取缓冲液( Tris-HCL ,%SDS,10%甘油和5%β-巯基乙醇)
50ml上样缓冲液配方:-HCl (PH=):10ml,SDS:2g,溴酚蓝:,β-巯基乙醇:10ml
2实验步骤

方法一:采取Tris-***法进行蛋白提取,方法如下:
(1),加入适量液氮后迅速将其磨成粉末。(2),加入4倍鲜叶体积即2ml蛋白提取缓冲液充分研磨。
(3)4℃下45min,后离心(4℃,15000g,15min)
(4) -20℃预冷的***,-20℃下静置45min,之后同上离心,取沉淀在-20℃下静置挥去***。
(5)加入1ml上样液(% , Tris-HCL ),沉淀充分溶解后,同上离心,取上清液即为待测蛋白溶液。
方法二:取1~2g茶鲜叶加入等量PVPP和少量石英砂,液氮研磨,加入pH ,15000 g、4℃离心15 min,上清液即为粗酶液。粗酶液放于4℃冰箱中保存备用。
蛋白定量采用G-250法(Bradford法)