文档介绍：指导教师:左泽乘
拟南芥蓝光受体CRY2氧化还原机制研究
班级:13级农业资源与环境
负责人:杨德红
组员:王悦全豪
杨亚珍段春雪
研究背景及原理
植物有两类光受体:一类是光合色素,为光合作用获取光能;另一类是感光受体,调控非光合作用的光反应。
隐花色素CRY是一种蓝光受体。CRY基因首先是在拟南芥中分离出来的,目前在真菌、藻类、蕨类、高等植物和动物中都有发现。现在已发现有三种 CRY:CRY1、CRY2 和 CRY3。
促进幼苗光形态建成调节光周期控制开花
影响生物钟保卫细胞的发育气孔的开放
向性生长根发育的调节细胞程序性死亡
隐花色素简介:
隐花色素结构
隐花色素CRY是一种黄素蛋白。
PHR结构域在进化上非常保守,并且为隐花色素的发色团绑定结构域,通过非共价键结合生色团FAD
CCE构域是隐花色素的功能结构域。
光裂解酶/隐花素结构图
隐花素N端氨基酸序列高度同源于DNA光裂解酶,结构也非常类似。拟南芥CRY1 PHR域三维结构非常类似于光裂解酶,暗示隐花素光激活的机制有可能类似于光裂解酶的光化学机制。
黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是双电子载体
能以三种不同的氧化还原状态或五种不同的质子化形式存在:氧化态(FAD)、半氧化态(自由基负离子 FAD-或自由基 FADH+)、还原态(负离子 FADH-或 FADH2)
不同氧化还原形式中,只有氧化态FAD 和半氧化态自由基负离子 FAD-吸收大部分的蓝光(大约 400-500 纳米。
CRY2与FAD作用机理
反应机理
CRY2经历光循环,在此过程中完全氧化态FAD表现出基态和半还原态FADH-。在蓝光照射下FADH-积累,而CRY2的激活型包含FADH-。
信号蛋白的一个重要特征就是蛋白的快速代谢从而使生物体恢复到信号刺激前的状态。
隐花色素CRY2的降解依赖于FAD,当CRY2突变(CRY2D387A)丧失结合FAD的能力后,该突变的蛋白不再经历蓝光诱导的降解过程。
氧化态的FAD
FADH+
/FAD-
吸收蓝光被还原
黑暗中被氧化
基态
信号态
实验创新点:
利用roGFP蛋白作为氧化还原变化的指示蛋白,定性、定量检测蛋白水平氧化还原电极电势变化。
过上述实验手段预计能够初步了解蓝光下拟南芥隐花色素CRY2氧化还原变化情况。
实验目标:
研究方案
引物设计
RNA提取、反转录
融合表达蛋白并测序
构建表达载体
转染宿主细胞
培养细胞
目的蛋白的分离纯化
进行氧化还原和蓝光照射实验,检测蛋白性质
实验意义:
通过实验初步了解蓝光下拟南芥隐花色素CRY2氧化还原变化情况,从而调控植物的生长发育过程。