小肠上皮细胞培养.ppt

文档介绍：肠上皮细胞培养技术
报告人:欧阳万金

肠上皮细胞
肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECS)是具有极性的柱状上皮细胞,参与肠道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和应激反应等,黏膜上皮内含有大量的免疫细胞和免疫分子,是机体内最大的免疫组织。
IEC是体内更新最快的一类细胞,对维持肠上皮的功能有重要作用。其快速更新的特性,使其成为研究细胞增殖和分化调控机制、营养素对肠上皮的作用、细胞信号转导、肠道免疫等提供了理想的体外模型。
胶原酶Ⅳ消化法得到的兔IEC
鸡胚盲肠上皮细胞呈铺石路生长(400×)
准备工作
1、对所需用到的器皿的清洗、干燥、消毒
2、培养基和其他试剂的配制、分装及灭菌
3、无菌室或超净台的清洁与消毒
4、培养箱及其他仪器的检查与调试
IEC的培养流程
幼龄动物小肠
→
单个细胞
→
细胞悬液
→
细胞贴壁生长
→
细胞悬液
→
细胞株或细胞系
剪碎
胰蛋白酶
原代培养
胰蛋白酶
传代培养
IEC的培养分为原代培养和传代培养。
分离细胞后立即进行培养称为原代培养,一般将培养的第1代与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养;
存活的原代培养细胞(细胞株)进行传代,称为传代细胞培养。
影响IEC培养的因素
1、材料来源
以取自刚出生且未进奶的新生大鼠最好。
对已进食的新牛大鼠,分离培养过程中使用的培养液、细胞洗涤液(Hanks液)和组织分散液中均应加入2倍浓度的抗生素。
2、消化酶的选择
%胰酶消化组织,室温下需约1 h,分离得到的大部分为单个细胞,贴壁和生长能力均较差。
胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶I的联合使用,室温消化约40 min即可得到IEC团块,其贴壁能力较强,牛长状态良好,还可减轻对细胞毒性损害,缩短消化作用时间,且肠绒毛细胞团的产率较高。
用嗜热菌蛋白酶作为分离IEC的消化酶,经简便纯化,即可获得较纯的IEC。
3、血清浓度
使用胎牛血清浓度不宜过高,10%-20%胎牛血清常使非肠黏膜上皮细胞增殖。
IEC体外培养所用的胎牛血清的浓度一般不超过5%。
4、IEC的纯度
少量异源细胞的存活对IEC生长繁殖也是重要的,因为IEC与间质细胞存在相互作用关系。
同时应防止其过度繁殖,如降低FCS浓度可减少成纤维细胞和平滑肌细胞增殖。
应用肝素可抑制平滑肌样细胞生长,促进IEC生长增殖。