文档介绍：南京农业大学生命科学学院
生物化学技术原理及应用
第二章沉淀法
沉淀法是纯化生物大分子常用的一种经典方法。该法操作简单,成本低廉,一般包括盐析沉淀、有机溶剂沉淀和选择性沉淀等类型。
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生命科学学院生物科学51班
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第二章沉淀法
基本原理
蛋白沉淀法
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核酸沉淀法
第一节沉淀的基本原理
沉淀法也称溶解度法。
其纯化生物大分子的基本原理是:
根据各种物质结构的差异(如蛋白分子表面的疏水基团和亲水基团之间比例的差异)来改变溶液的某些性质(如pH、极性、离子强度、金属离子等),就能致使抽提液中有效成分溶解度的变化。
则可通过选择适当的抽提溶剂使欲分离的有效成分最大溶解,而杂质最小溶解;或者相反。从而达到分离的目的。
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第一节沉淀的基本原理
蛋白沉淀法:
盐析法
有机溶剂沉淀法
蛋白质沉淀法
核酸沉淀:
有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法
其它沉淀剂沉淀法:聚乙二醇(PEG),十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),LiCl,精胺,钙盐。
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聚乙二醇沉淀法
选择性沉淀法
结晶沉淀法
第二节蛋白沉淀法
1. 盐析法
原理:
根基蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高而上升(盐溶)
但当盐浓度增高到一定数值时,其溶解度又逐渐下降,直至蛋白质析出(盐析)。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时,使水活度降低,进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和,水化膜逐渐被破坏,最终引起蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。
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第二节蛋白沉淀法
1. 盐析法
盐的选择
一般蛋白沉淀时选用硫酸铵,原因:
溶解度大,对温度不敏感
分级效果好
有稳定蛋白质结构的作用
价格低廉,废液可以肥田
盐析的缺点:样品继续纯化时须脱盐。
硫酸铵的缺点是铵离子干扰双缩脲反应,为蛋白质的定性分析造成一定困难。
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第二节蛋白沉淀法
1. 盐析法
硫酸铵盐析
固体法。在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵,当达到一定饱和度时,蛋白质便可沉淀下来。
饱和溶液法。较固体法温和,但不适用于大体积样品,会导致样品体积大量增加。
透析法。将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中,通过透析作用改变蛋白质溶液中的盐浓度。该法盐浓度以连续状态变化,避免局部盐浓度过高的不良影响,分级效果好。但受透析袋容积、盐析速度、及硫酸铵耗费大的制约,仅用于精确、样品体积小的试验中。
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