文档介绍：人类外周血培养及染色体核型分析
一、实验目的:
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二、实验原理:
1、植物血凝素的作用
外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期,一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时,这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞,进而开始进行有丝分裂。
2、秋水仙素的作用:
秋水仙素(colchicines)可以抑制细胞纺锤体的形成,使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。
使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩,因此在处理时间和浓度上要合适。
3、低渗的原理:
徐道觉()等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理,可以使细胞的核膜吸水膨胀,滴片后细胞破裂,染色体分散开来,在显微镜下易于观察和统计,染色效果也明显提高。
这种技术被广泛采用后,使人类染色体分析技术得到了发展。
4、核型和带型:
核型(karyotype):
是指染色体组在有丝分裂中期的表型, 是染色体数目、大小、形态特征的总和。
在对染色体进行测量计算的基础上, 进行分组、排队、配对, 并进行形态分析的过程叫核型分析。
将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来,再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图,它代表一个物种的核型模式。
带型(banding pattern)
即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序,使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性,所以每一条染色体都有固定的分带模式,即称带型。
常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。就每一种分带技术而言,每一染色体的带型是高度专一和恒定的。
三、实验用具及试剂:
实验仪器及用具:
恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪;
培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。
2. 实验试剂:
外周血淋巴细胞培养基
2%碘酒
75%酒精
20µg/ml秋水仙素
mol/L KCl溶液
甲醇
冰醋酸
Giemsa原液
1/15 mol/L磷酸缓冲液
四、实验步骤:
1、采血:将皮肤常规消毒后静脉采血约 ml。
2、种血及培养:将采到的血样立即接种到培养瓶内,每个培养瓶接25-28滴(),轻轻摇匀后将培养瓶放在37℃温箱中培养72小时。培养过程中,每天应轻轻摇动两次培养瓶。
3、秋水仙素处理:在终止培养前4小时,向培养瓶中加 20µg/ml的秋水仙素20µl,轻轻摇匀后继续培养到72小时。
4、制片:
(1)离心:从温箱中取出培养瓶,用吸管将培养液转入10ml的刻度离心管内。2000转/分,离心10分钟。
(2)低渗:弃去上清液。加入37℃预热的
KCl低渗液6-8ml,用吸管轻轻吹打均匀,放在37℃恒温水浴中30分钟。(此时配固定液:甲醇225ml+冰醋酸75ml )
(3)预固定:在离心管中加入现配的