文档介绍：人类外周血培养及染色体核型分析一、实验目的:•学****外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法;•利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本;•利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。二、实验原理:物血凝素的作用外周血中的淋巴细胞几乎都是处在GO或G1期,一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时,这种小淋巴细胞受到剌激后转化为淋巴母细胞,进而开始进行有丝分裂。2、秋水仙素的作用:秋水仙素(colchicines)可以抑制细胞纺锤体的形成,使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩,因此在处理时间和浓度上要合适。3、低渗的原理:徐道觉()等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理,可以使细胞的核膜吸水膨胀,滴片后细胞破裂,染色体分散开来,在显微镜下易于观察和统计,染色效果也明显提高。这种技术被广泛采用后,使人类染色体分析技术得到了发展。4、核型和带型:核型(karyotype):是指染色体组在有丝分裂中期的表型,是染色体数目、大小、形态特征的总和。在对染色体进行测量计算的基础上,进行分组、排队、配对,并进行形态分析的过程叫核型分析。将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来,再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图,它代表一个物种的核型模式。带型(bandingpattern)即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序,使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性,所以每一条染色体都有固定的分带模式,即称带型。常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。就每一种分带技术而言,每一染色体的带型是高度专一和恒定的。三、实验用具及试剂:实验仪器及用具:恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪;培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。实验试剂:外周血淋巴细胞培养基2%碘酒75%酒精20pg/、实验步骤:1、采血:将皮肤常规消毒后静脉采血约0・5ml。2、种血及培养:将采到的血样立即接种到培养瓶内,每个培养瓶接25-28滴(),轻轻摇匀后将培养瓶放在37X?温箱中培养72小时。培养过程中,每天应轻轻摇动两次培养瓶。3、秋水仙素处理:在终止培养前4小时,向培养瓶中加20Mg/ml的秋水仙素20|il,轻轻摇匀后继续培养到72小时。4、制片:离心:从温箱中取出培养瓶,用吸管将培养液转入10ml的刻度离心管内。2000转/分,离心10分钟。低渗:弃去上清液。・8ml,用吸管轻轻吹打均匀,放在37C恒温水浴中30分钟。(此时配固定液:甲醇225ml+冰醋酸75ml)预固定:在离心管中加入现配的预温的甲醇•冰醋酸(3:1)固定液约lml,轻轻混匀,379固定15分钟。再次离心:2000转/分离心10分钟。第一次固定:弃上清液,加入固定液约7ml,立即用吸管吹打使之成细胞悬液,室温固定20分钟。2000转/分离心10分钟。(6)第二次固定:同第一次定。弃上清液,