文档介绍：淋巴细胞分离与计数
淋巴细胞分离
原理:
外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。
实验材料:
淋巴细胞分离液
肝素
稀释液(生理盐水)
RPMI1640粉末
实验设备:1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜
操作流程:
在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。
无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中,( 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝
稀释(外周血:稀释液=1:2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀)
用刻度吸管沿倾斜的管壁,把稀释血缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面(Ficoll:稀释血=1:2)
放入离心机1500r/min 离心20min(注:缓慢加速1-4档个3分钟)
用吸管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一离心管中,加入5倍以上体积的稀释液(生理盐水),1500rpm×10分钟离心,洗涤细胞。
重复洗涤一次,1500rpm×10分钟离心。
末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞
计数细胞后再调整细胞置所需浓度.
%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)=
4个大方格内细胞总数
──────────× 104×2(稀释倍数)
4
分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。
注意事项:
每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞
Ficoll应适量,外周血应充分稀释
温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果
在Ficoll上加入稀释外周血时,