文档介绍：分子遗传学实验
PCR产物克隆及质粒的少量制备
(8学时)
实验目的
掌握DNA回收、基因克隆、克隆筛选、质粒提取和DNA测序的原理和方法
认识到基因克隆在基因工程领域地位,理解基因工程的含义与应用
实验流程
目的基因的获得
载体DNA的选择
重组:DNA片段与载体连接
重组体转化
转化子的筛选、鉴定
提取质粒
目的基因
基因载体
重组体
分
切
接
转
筛
总体技术路线
实验材料
小鼠基因组
PCR使用的各种试剂
感受态大肠杆菌
培养皿
固体液体培养基
T载体试剂盒
质粒小量提取试剂盒
目的基因获得 ——PCR方法原理
PCR (Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链式反应原理
PCR是一种模拟天然DNA复制的体外扩增法。通过试管反应使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段,在短短几小时内扩增上百万倍。
PCR就是反复进行变性—退火—引物延伸三个步骤的循环过程:
1. 变性:DNA在高温(94~95℃)下变性,双链单链
2. 退火:将反应混合物降温,使引物与单链DNA模板(或从mRNA逆转录而来的cDNA)上互补的序列复性,即退火,形成模板-引物复合物。
3. 延伸:溶液反应温度升至72℃,耐热的DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5’3’方向复制出互补DNA。
PCR原理
PCR步骤
PCR技术的基本过程
模板DNA
dNTP
引物
Buffer
预变性
模板DNA
dNTP
引物
Buffer
循环仪
94oC 5’
94℃
55 ℃
72 ℃
TaqDNA聚合酶
水
20
PCR buffer
dNTPs
上游引物(F)
下游引物(R)
模板DNA
Taq DNA聚合酶
总
25
PCR 反应体系
单位:μL
预变性95℃
5min
变性95℃
30s
一定温度
退火
30s
延伸72℃
50s
延伸72℃
7min
4℃保存
结束
35个循环
PCR 反应程序
依据合成引物报告,在PCR仪上设计好退火梯度,操作如下:
PCR结果检测—琼脂糖凝胶
PCR产物的回收
按照PCR产物回收试剂盒回收
目的DNA片段,检测回收产物。
载体DNA的选择——质粒
载体应具有如下基本特点:
重组体转入宿主细胞后应具有随细胞增殖而增殖的能力;
具备插入外源基因的酶切位点、要求载体上具有筛选的标记。
常用的载体有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体
质粒
质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在1~200kb之间,具有双链闭合环状结构的DNA分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。具有自主复制和转录能力。
⑴分子量相对较小,在细菌中稳定存在,拷贝指数高。
⑵具有遗传标记: 如抗生素性基因—半乳糖酶基因(LacZ)
⑶具有多个酶的单一切点。称多克隆位点(multiple cloning sites , MCS)