文档介绍：分子克隆实验报告实验名称:实验类型:指导教师:班级:姓名:学号:实验时间:分子克隆、分子杂交、基因表达检测综合性李一博A孙阳阳20143041101002015/8/19—2015/8/25实验一分子克隆DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分实验原理及方法DNA提取:(CTAB法)CTAB是一种非离子去污剂,植物材料在CTAB的处理下,结合65°C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物,此复合物在高盐(>)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(-)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后,CTAB-核酸复合物再用70-75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。感受态细胞的制备及质粒的转化质粒提取:~,细菌大分子量染色体DNA变性分开,而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNACaCl2法:利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞,可以诱导其产生短暂的“感受态”,易于摄取外源DNA。106~107转化子/mgDNA。酶切酶连:限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平末端的外源片段,经纯化处理后的DNA用于连接反应;选择克隆载体pUC19多克隆位点上相应的限制性内切酶切割,并用碱性磷酸酶处理防止载体自连;在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上,实现外源片段的克隆。实验材料和试剂携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液;携带含有水稻DNA片段的M812载体的大肠杆菌菌液;氨苄青霉素、卡那霉素;RNaseA;碱裂解法试剂SolutionI:()50mMM5P5M6P6EDTA10mMRNaseA100µg/mlSolutionII:%SolutionIII:():()10mMEDTA()1mM苯酚/氯仿、,-20℃保存。菌种PUC19M812个人编号56785678浓度ng/.,只检测条带不有点markerM5、M