文档介绍：HBV-DNA检测(PCR)作业指导书
1. 目的:规范本中心对乙型肝炎病毒DNA定量检测的方法细则。
2. 范围:乙型肝炎病毒DNA定量检测。
3. 职责:
检测人员:负责按照本检测细则对被检样品进行检测。
复核人员:负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核。
科室负责人:负责对科室综合管理和检测报告的签发。
4. 方法:实时荧光PCR法
5. 仪器:博日FQD-48(M4)荧光定量PCR仪
6. 试剂与材料
试剂来源:北京华大吉比爱生物技术有限公司,试剂有效期为12个月。
材料:PCR所使用的吸管、试管、加样枪头以及微量离心管都应一次性使用。特别是微量离心管和试管都应为无菌。
可调移液器(~10ul、10~200ul、100~1000ul)应该用重量法效正后再使用。
操作步骤
样本要求:
、血清:1600rpm20分钟分离全血取血清;
、血浆:EDTA抗凝剂,1600rpm20分钟,分离血浆。

、待测血清/血浆及对照个100ul,;
、再加100ul浓缩液,振荡混匀,13000rmp10分钟,弃上清液;
、然后加入10ul内参对照品,50ul核酸提取液;
、100℃干浴或沸水浴10分钟,13000rmp离心10分钟,吸取上清液备用。

、核酸反应液振荡混匀,2000rpm10秒;
;
(样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管弱阳性对照+4管工作标准品)
:加入处理过的样品个5ul,盖紧管盖,2000rpm10秒。
PCR 扩增
反应程序如下:
步骤
温度
时间
循环数
1
50℃
2min
1
95℃
5min
2
95℃
15s
40
60℃
45s(荧光收集步骤)
仪器检测通道选择:
HBV发光荧光基团为FAM,淬灭荧光基团为TAMAR荧光素,参考荧光基团为Rox荧光基团。
8. 结果判断:
分析软件自动结合,4个定量校准品制定标准曲线,并计算各样品的结果。
定性结果判断:
R≤×103,即为原始样品阴性