文档介绍：石蜡和冰冻切片检测牛蛙肝糖原的染色效果比较
肝糖原是人和动物体内的贮备多糖,有动物淀粉之称,肝糖原在酶促作用下合成和分解以维持血糖浓度稳定。检测肝糖原含量变化在医学病理学上可用于糖原累积病﹑糖尿病和某些肿瘤的诊断[1],在养殖生产实践中可用于了解动物的营养状况以指导合理饲喂。高碘酸希夫氏(periodic acid-Schiff′s,PAS)染色法是检测糖原的经典组织化学方法,该法先用高碘酸将糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基,再用Schiff's试剂(无色品红)和醛基反应产生红色或紫红色物质,红色的深浅反映组织细胞中糖原的含量。目前对肝糖原PAS染色过程中样品固定、染色试剂的配制与储存、染色时间等方面研究报道较多[2-4],切片方法均为石蜡切片,冰冻切片制作过程时间短、效率高,但尚未见有关用冰冻切片检测肝糖原的研究报道。
牛蛙属经济养殖型蛙类,具有重要的生态价值和经济价值,也是重要的科研和教学用实验动物。
本试验分别制作了牛蛙肝组织石蜡和冰冻切片,采用PAS染色法检测肝糖原,通过光密度分析测定糖原含量,比较了两种切片的染色效果,供相关教学与科研技术人员参考。
材料和方法
成体牛蛙3只,重250-300g,购自芜湖市黄山菜市场,穿刺脊髓处死,迅速解剖,取出肝脏,用吸水纸轻轻拭干,勿用水或生理盐水清洗。
,用Carnoy固定液于低温4℃固定约4h,分别用95%乙醇和无水乙醇脱水2h、二甲苯透明、浸蜡、包埋,常规切片厚5μm,水中展片。
,放在组织支撑器上,滴加冷冻包埋剂后放入冰冻切片机中低温固化后切片,切片厚5μm。
对照组取石蜡切片常规脱蜡至50%乙醇后稍水洗,与冰冻切片同时滴加唾液淀粉酶溶液于37℃温箱中消化处理30min,消化过程中实验组石蜡切片脱蜡至50%乙醇后稍水洗,将实验组、对照组的石蜡、%高碘酸氧化7min,流水冲洗5min再用蒸馏水浸洗两次;冰箱取出无色品红待至室温后避光染色15-20min;%的偏重亚硫酸钠漂洗两次,每次约1min,流水冲洗5min,蒸馏水洗后Harris苏木精染色2 min;自来水洗,%的盐酸乙醇分化1 min,水洗充分后温水返蓝,流水冲洗,42℃温箱烘干24h,中性树胶封固。
在Olympus BX61型显微镜下观察拍照,采用Image-Pro Plus图像分析软件对染色阳性部位进行光密度分析,测出切片中PAS阳性部位的累积光密度(integrated optical density,IOD)和面积,算出平均光密度(mean optical density,MOD)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异显着性比较,P<。
结果
PAS染色后糖原颗粒呈红色或紫红色,石蜡切片染色后肝脏组织结构较为清晰,但肝细胞内有较多空泡,糖原流失较多,且偏向了细胞的一侧(图1),冰冻切片肝细胞形态保持完好,糖原颗粒明显比石蜡切片中大,且糖原保持较好的原位状态(图2)。
光密度分析显示