单色荧光标记表达谱芯片.doc

文档介绍：单色荧光标记表达谱芯片
实验流程
准备One-Color Spike Mix【根据上样量选择稀释步骤】
将One-Color Spike Mix stock solution在vortex上混匀,37度处理5分钟,在vortex上混匀,然后瞬时离心。
第一次稀释:在第一个管子上标注第一次稀释spike-in,在vortex上混匀spike mix,37度循环水浴中加热5分钟,vortex再次混匀,瞬时离心。在管子中加入2 ul的spike mix。再加入38 ul Dilution Buffer,vortex混匀,瞬时离心。
第二次稀释:在第二个管子上标注第二次稀释spike-in,加入第一次稀释液 2 ul,再加入48 ul Dilution Buffer,vortex混匀,瞬时离心。
第三次稀释:在第三个管子上标注第三次稀释spike-in,加入第二次稀释液 2 ul,再加入38 ul Dilution Buffer,vortex混匀,瞬时离心。
第四次稀释:在第四个管子上标注第四次稀释spike-in,加入第三次稀释液 10 ul,再加入30 ul Dilution Buffer,vortex混匀,瞬时离心。
保存:Store the Agilent RNA Spike- In Kit, One- Color at –70°C to –80°C in a non- defrosting freezer for up to 1 year from the date of receipt. The first dilution of the Agilent One- Color Spike Mix positive controls can be stored up to 2 months in a non- defrosting freezer at - 70°C to - 80°C and freeze/thawed up to eight times.
探针标记
将25-200 ng ul。【RNA保存要浓度大于100ng/ul,使用时再稀释】
每个管里加入2 ul稀释后的spike mix, ul。
按照下表配制
ul T7 Promoter Primer Mix, ul。
65度水浴中10分钟,使引物和RNA变性。
冰上放置5分钟。
将5X first strand buffer于80度预热3-4分钟。Vortex混匀,然后瞬时离心。室温放置待用。
按照上表配制cDNA Master Mix。
瞬时离心每个反应管, ul cDNA Master Mix,用枪混匀,终体积10 ul。
将反应管在40度水浴中,放置2小时。
然后转入70度水浴中,放置15分钟。
然后冰上放置5分钟,瞬时离心。
保存:如果想在此暂停实验,可以放置于-80度保存。
按照下表配制Transcription Master Mix
每反应管加入6 ul Transcription Master Mix,用枪混匀,终体积16 ul。
然后在40度水浴中处理2小时。
保存:如果想在此暂停实验,可以放置于-80度保存。