文档介绍：实验8 质粒DNA的提取(碱裂解法)
一、实验目的
了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用,掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。
二、实验原理
碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。碱性(pH ~)条件可以破坏碱基配对,宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时(加入酸性试剂中和),共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对,重新形成完全天然的超螺旋分子;而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性,会交联形成不溶于水的线团结构,缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀下来,而质粒DNA则留在上清液中,用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。
三、仪器设备
微量取液器(2 μL;20 μL;200 μL;1 000 μL),tip头,手掌型离心机, mL离心管, 恒温水浴,制冰机,超净工作台,恒温培养箱。振荡器,离心机,金属浴,电泳仪,凝胶成像仪。
四、实验试剂
(1)溶液Ⅰ:50 mmol/L葡萄糖;20 mmol/L Tris·HCl(pH = );10 mmol/L EDTA(pH=),高压蒸汽灭菌(121 ℃, Mpa)20 min。4 ℃贮存。
(2)溶液Ⅱ(现用现配): mol/L NaOH;1 g / L SDS。
(3)溶液Ⅲ(pH ):每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL; mL;H2O mL。
(4)RNase(10 mg / mL),LB液体培养基,氨苄青霉素,异丙醇,70 %(V / V)乙醇,无菌水。
五、实验方法
(1)分装3 mL LB液体培养基和3 μL氨苄青霉素(50 mg/mL)于15 mL玻璃试管中。
(2)用灭菌牙签挑取一白色单克隆,放入玻璃管内,置37 ℃恒温摇床中以200转/min培养,至OD600=。
(3) mL的Eppendorf 管中,将离心管放入冷冻离心机,调温至4 ℃,转速3 500 g,离心5 min,收集细菌。弃上清,倒置于吸水纸上,沥干残液。
(4)每离心管中加入冰上预冷的溶液Ⅰ 200 µL,置振荡器上剧烈震荡,悬浮菌体。
(5)加入新配制的溶液Ⅱ 400 µL,翻转10次。冰上放置。
(6)冰浴3 min内迅速加入300 µL溶液Ⅲ,温和翻转10次,冰浴10 min。
(7)将离心管放入冷冻离心机,调温至4 ℃,转速12 000 g,离心5 min。取上清液于新管中,同时加入Rnase(10 mg/mL)10 µL,混匀,37 ℃保温2 hr。
(8)加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),置摇床上震荡5 min,将离心管放入冷冻离心机,调温至4℃,转速12000 g,离心10min。
(9)取上清液于新的离心管内,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),摇床震荡5 min。
(10)将离心管放入冷冻离心机,调温至4 ℃,转速12 000 g,离心10 min。取上清,加入等体积异丙醇,迅速翻转5次,冰上放置10 min。
(11)将离心管放入冷冻离心机,调温至4 ℃,转速12 000 g,离心10 min。弃上清,倒置于吸水纸上。加入500