文档介绍：Questions
A、pro萃取?
B、胞内酶的萃取?
C、包含体的pro复性?
第11章 双水相萃取
双水相系统(aqueous two-phase systen, ATPS)
PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol)
Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖(dextran)
1、Pro如何分布
2、影响因素
3、应用
第11章 双水相萃取
1、 ATPS相图
2、蛋白质的分配平衡
3、影响蛋白质m的综合因素
4、体系的选择和优化
5、 Applications
1 ATPS相图
双节线(bi-nodal):
图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区,即ATPS 。
系线(tie line):
双节线上两点的直线。
系线(tie line)反映的信息
A 杠杆规则:系线上各点均为分成组成相同,而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则
B 性质差异:系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大;反之则越小.
C 临界点(critical point):当系线长度趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。
2 蛋白质的分配平衡
1)、分配系数m
2)、m贡献因子
me、mb和ma分别为静电、疏水和亲和作用对溶质m的贡献.
3)、静电作用
电中性pro的m0:
式中, M: 溶质分子量; : 溶质在上下两相表面自由能的差, J/mol。
意义:
A 不受静电作用的影响(因不带电);
B 一般> 0,溶质lnm随M而;
C ATPS不同, 同一溶质的也就不同,m随ATPS不同而改变。
图是不同pro在pH为各pro的pI的ATPS中的m,
2 蛋白质的分配平衡
陶南电位(, Donnan potential)
实际ATPS中有电解质, 当这些离子在两相中m 1), 将两相间产生电位差
带电pro的m:
意义:
A 荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比.
B 由于同一ATPS中添加不同的盐产生的不同,故m与Zpro的关系因盐而异。
2 蛋白质的分配平衡
4)、疏水作用
相间疏水因子(HF, hydrophobic factor)
PEG/DX和PEG/KPi等ATPS上相(PEG相)疏水性较大,相间的疏水性差用HF表示. HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:
RH-aa相对疏水性(relative hydrophobicity).是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=,上式中的B为:
mGly为Gly分配系数. 所以, pH=pL时aa在ATPS中的分配系数与其RH值呈线性关系,.
2 蛋白质的分配平衡
Pro表面疏水性(HFS, HF of surface)
= pI的ATPS中, pro的m0与HF值之间呈线性关系, 则直线的斜率定义为该蛋白质的HFS
图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。图的结果示:pro的HFS随NaCl浓度的增大而增大。将盐对pro的HF影响上式得:
其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。因此,m的一般形式
意义:
3 影响蛋白质m的综合因素
1)、成相聚合物浓度和M
分子量M: 若降低聚合物的M,则pro分配于富含该聚合物的相中。如PEG/DX系统,若降低DX的M,则m减小。这一规律具有普遍意义。
成相系统的总浓度:增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1),,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相.
.
实验结果
3 影响蛋白质m的综合因素
1)、成相聚合物浓度和M
存在问题:当系线长度增加时,系统的表面张力增大,,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,.,一般可不考虑。
实验结果