文档介绍：沉淀技术
第四章
沉淀技术
第一节蛋白质沉淀的基本原理
第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用
第一节蛋白质沉淀的基本原理
一、蛋白质的溶解性
蛋白质是由许多氨基酸缩水形成的一条或几条多肽链所组成的两性高分子聚合物,溶解性是由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。在水溶液中,多肽链中的疏水性氨基酸残基向内部折叠的趋势,使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体机构的外表面。因此,蛋白质表面大部分是亲水的,而其内部大部分是疏水的(见图4-1) ,亲水和疏水区域的分布和程度将决定蛋白质在水相环境中的溶解程度。在生理pH值条件下,如果这些可离子化的基团和水分子在蛋白质表面同时存在,则离子化基团至少能部分带电并被溶剂化。分子量的大小对蛋白质的溶解度也会有影响,通常情况下分子量小的蛋白质比起在结构上类似的大分子量蛋白质更易溶解。
第一节蛋白质沉淀的基本原理
另外,蛋白质的溶解度同样也取决于所处环境的物理化学性质。影响蛋白质溶解度的外部因素主要有温度、pH、介电常数和离子强度。但是在同一特定的外部条件下,不同的蛋白质具有不同的溶解度,这是因为溶解度归根结底取决于溶质本身的分子结构。如分子所带电荷的性质和数量、亲水与疏水基团的比例及两种基团在蛋白质分子表面的排列等。
第一节蛋白质沉淀的基本原理
影响蛋白质溶解度的主要因素分成蛋白质性质和溶液性质两类。蛋白质性质的因素有:分子大小、氨基酸组成、氨基酸序列、可离子化的残基数、极性/非极性残基比率极性/非极性残基分布、氨基酸残基的化学性质、蛋白质结构、蛋白质电性、化学键性质;溶液性质的因素有:溶剂可利用度(如水)、pH值、离子强度、温度。由于改变蛋白质性质较难,故对其溶解度的调控,常常是通过改变溶液的性质来实现的。
当然,蛋白质也可用改变其结构的办法来使其不可溶,改变的方法是使埋藏在分子内部的疏水基团暴露出来,但这种分子结构的改变是不可逆转的,会引起蛋白质的变性。利用蛋白质的相对热稳定性,进行选择性变性,以用于蛋白质的分离,但这并不是真正的沉淀过程。
第一节蛋白质沉淀的基本原理
二、蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子是分散相,水是分散介质。就其分散程度来说,蛋白质溶液属于胶体系统,但是它的分散相质点是分子,它是蛋白质分子与溶剂(水)所构成的均相系统,分散程度以分散相质点的半径来衡量。根据分散程度可以把分散系统分为3类:分散相质点小于1nm的为真溶液,大于100nm的为悬浊液,介于1nm~100nm的为胶体溶液。从蛋白质相对分子量的测定和形状的观测知道,其分子的大小已达到胶体质点1nm~100nm范围之内,具有胶体性质,如布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、粘度大以及不能透过半透膜的性质等。
第一节蛋白质沉淀的基本原理
球状蛋白质的表面多亲水基团,具有强烈地吸引水分子作用,使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围。实验证明,~,使蛋白质分子表面形成一层水膜,称水化膜。蛋白质分子表面具有许多可解离的基团,因此在一定的pH条件下,能与其周围电性相反的离子形成所谓双电层。由于水化层和双电层这两种稳定的因素,使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液。由于水化膜和双电子层的存在,蛋白质颗粒彼此不能接近,因而增加了蛋白质溶液的稳定性,阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来。
第一节蛋白质沉淀的基本原理
三、沉淀动力学
溶解度是一个平衡特性,但是溶解度值降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后,分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起:①热运动(布朗运动);②对流运动,由机械搅拌产生;③差速沉降,由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中①和②两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用,第3种机理在沉降过程中起主导作用(如在废水处理中)。由布朗运动所造成的碰撞导致异向聚集,而由对流运动所造成的碰撞导致同向聚集。
第一节蛋白质沉淀的基本原理
为了简化沉淀过程的动力学,可把沉淀过程分成下述6个步骤:①初始混合,蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合;②晶核生成,新相形成,产生极小的初始固体微粒;③扩散限制生长,晶核在布朗扩散作用下生长,生成亚微米大小的核,这一步速度很快;④流动引起的生长,这些核通过对流传递(搅拌)引起的碰撞进一步生长,产生絮体或较大的聚集体,这一步是在较低的速度下进行的;⑤絮体的破碎,破碎取决于它们的大小、密度和机械阻力;⑥聚集体的陈化,在陈化过程中,絮体取得大小和阻力平衡。
第一节蛋白质沉淀的基本原理
沉淀剂的性质和浓度,加入蛋白质溶液的方式,反应器的几何形状和水力学特性都会影响沉淀过程的动力学和聚集体的数量与大小。沉淀剂的加入可快可慢,可以溶液形式也可以固体形式加入(如硫酸铵)。在搅拌式反应器或管式反应器或活