细胞免疫功能检测方法.ppt

文档介绍：细胞免疫功能检测方法 ELISPOT的建立及应用
指导老师: 常维山教授
柴家前副教授
刘永庆教授
报告人:李梅
ELISPOT是什么?
ELISPOT : 全名为酶联免疫斑点检测。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术,能够在单细胞水平检测细胞因子等分泌物的分泌情况
原理可概括为:用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子,并以酶联斑点显色方式将其表现出来(Sedgwick JD 2005)。
ELISPOT检测的优点
灵敏度高:在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。灵敏度高于ELISA 。
单细胞水平:ELISPOT 检测的是单个活细胞的分泌。
操作简便:不需专门的实验仪器设备。可按照标准化的实验操作,可以同时处理数百个样品(Kalyuzhny AE 2005)。
ELISPOT的流程
底板与捕捉抗体的包被
底板类型:***纤维素膜板、PVDF膜板等
捕捉抗体:如抗某细胞因子抗体(Purified Rat Anti-Mouse IFN-r Monoclonal Antibody)。
抗体包被:用无菌PBS()来稀释包被抗体,包被量通常在1-2μg/mL( )。
次日倾倒包被液,PBS洗涤数次,在灭菌吸水纸上扣干后,用完全培养基37℃封闭2h。
倾倒封闭液, 加入检测细胞进行细胞培养。
标准曲线的建立和蛋白含量的确定
Folin酚法(20ug/ml-500mg/ml)
NDV浓缩抗原作1:25稀释,在650nm波长下比色,,带入回归方程式y=,求得蛋白含量为166μg /mL,所以NDV浓缩抗原的蛋白浓度为4150μg /mL。
脾淋巴细胞浓度对斑点数的影响
培养时间对斑点数的影响
NDV抗原浓度对斑点数的影响