文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
非病毒载体介导hBMP-2转染人皮肤成纤维细胞后诱导成骨的研
究
姓名:杨永华
申请学位级别:硕士
专业:细胞生物学
指导教师:易静
20050501
日期:趔::拉烂挣取卑学位论文独创性声明学位论文使用授权声明日期:丝堕:圭日期;至蟹』有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查本人所星交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除文中已经注明引用的内容外。本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。本人完全了解上海第二医科大学有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名导师签名:
,,为骨形成蛋白,易宓囊辉保粲谧;ひ蜃右籇用,并被认为是中诱导成骨活性最强且可单独诱导成骨的细胞因子。蛋白可以通过旁分泌和自分泌的形式诱导新生骨的生成。,但因直接用药有相当大的缺陷,所以用一蚪芯植炕因治疗成为近几年骨修复的研究热点。迄今为止,骨修复的局部基因治疗采用的基因载体都是病毒,包括腺病毒、逆转录病毒及腺相关病毒,有引起严重免疫反应或致肿瘤危险,故不宜应用于临床。所以,本研究尝试用非病毒载体/阳离子脂质体介导一蚪肴似し舫上宋赴8方法有较高的转染效率且无上述危险。骨修复的局部基因治疗采用的基因携带细胞多为来源于成体骨骼肌肉系统的干细胞,取材不易,分离复杂,不能满足临床需要。而人皮肤成纤维细胞,与成骨细胞共同来源于胚胎间充质干细胞,无论是细胞形态还是在其他细胞表型上,二者均极其相似;且在某些诱导因素作用下,如培养液中加入胞来源广泛,取材容易,对供体部位损伤小,故可取自患者本人,避免了移植后的免疫排斥反应;且其容易转导入颍行Х置谙嘤蛋白,本身亦转化为成骨细胞,因此,将一虻既肴似し舫上宋赴校佣徊接盏几孟赴有关成骨基因的表达,有望使其成为一种理想的骨修复局部基因治疗的载体细胞。所以,:第一部分:非病毒载体一的构建及转染人皮肤成纤维细胞后人骨形成蛋白.,一琓易澹哂卸嘀止δ埽钕灾氖浅晒亲蛋白,成纤维细胞可向成骨细胞方向转分化并表达出成骨表型。另外,皮肤成纤维细上海第二医科大学预上学位论文
.鞍妆泶铮蛔H竞蟮“天,可检测到蛋白分泌至细胞外上清。体介导基因转染人皮肤成纤维细胞,收获转染后天的细胞,分别进行基因的表达目的:《局柿T靥澹用阳离子脂质体方法介导此质粒进入人皮肤成纤维细胞,检测转染后一方法:取儿童包皮环切术的皮肤废弃物,爬片分离获得人皮肤成纤维细胞,并大量扩增。从克隆载体谢竦胔虻娜ǔ洳迦胫柿上,构建真核表达质粒。以衾胱又、免疫组化、及觳庾H竞笙赴鹔虻淖B己结果:所构建质粒经双酶切及测序鉴定正确,从而得到真核表达的重组质粒。在阳离子脂质体榈枷拢琾质粒能瞬时转染人皮肤成纤维细胞,于转染后第欤杉鹔及结论:非病毒载体可成功介导一蚪肴似し敉宋赴⒃谧B及翻译水平获得目的基因的表达。第二部分::观察转染入基因的人皮肤成纤维细胞是否有成骨表型。体外试验:检测细胞的碱性磷酸酶,、徒涸和骨钙素/,的表达情况及矿化结节能否形成等。在体试验:将转染·一蚩赵靥錺柿5钠し舫上宋赴浦踩肼闶蠛笾ḿ肉内,考察可否成骨。方法:脂质体转染入人皮肤成纤维细胞后,于转染后用荧光法及酶细胞化学法检测细胞内穞的活性变化;转染后第天,以法观察型胶原的变化;转染后第天,用免疫组化法看骨桥蛋白有无表达;第天,用ǹ疾旃歉扑氐谋泶铮坏欤缢睾烊旧粤私饪蠡峤可否形成。转染细胞移植入裸鼠后肢肌肉内后,分别在第堋周、堋周、在人皮肤成纤维细胞内的表达。.鞍椎谋泶铩珹钚浴⒑私岷弦蜃觓、骨桥蛋白。周取标本,做的免疫组化及染色。上海第二医科大学硕士学位论文珻
结果:转染一蚝螅上宋赴诘腁活性在第天较转空载体者升高;转染后第天,膍鱿秩醯谋泶铮籌型胶原的转录无明显变对照组明显,但仅形成很小的矿化结节。在体实验:实验组芸杉∪饽谟衕蛋白阳性细胞,芘伎杉腥砉窍赴鱿郑哉兆榫薮讼窒蟆结论:经脂质体转染娜似し舫上宋赴杀泶锊糠殖晒潜型,但未能完全转分化为成骨细胞并诱导成骨,应进一步改善载体。第三部分:两种携带基因的真核表达载体间的比较目