文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
柯萨奇B3病毒VP1与人细胞蛋白直接作用的研究
姓名:黄孝天
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:刘晶星
20050501
淼巍纛嚣嚣~Ⅱ缸甀Ⅱ狟瓵籧··矗
,互补群氪苄青霉素抗性过硫酸铵碱基对焦碳酸二乙酯二甲基亚砜光密度聚丙烯酰胺凝胶电泳逆转录酶聚合酶链反应苯甲基磺酰氟亚单位卡那霉索抗性流式细胞分选术,甤...
学位论文使用授权声明学位论文独创性声明。本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,、使用学位论文的规定,学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的豹少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题职攘要汇缀出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。作者签名日期:
柯萨奇病毒肴讼赴鞍字苯幼饔玫难芯中文摘要湍杆咏挥斩靥宓墓菇ḿ霸谀鹁平湍钢械谋泶镉肫对报告基因的皇漱活检测柯萨奇病毒属于小《究频某Φ啦《臼簦芤鹑死喽嘀旨膊。心肌炎、心包炎、无菌性脑膜炎、干燥综合征甚至引起新生儿死亡。目前,人类特效药物用于临床治疗。荂闹饕=峁沟鞍祝哂惺种匾5墓δ堋R环矫娑晕植《镜完整形态有重要作用,另一方面与宿主致病性密切相关。但目前的相关研究主要集中在动物水平的致病机制研究、疫苗研究或细胞水平的细胞表面受体研究。对近年来创立的酵母双杂交系统是一种新型的、发现蛋白质相互作用的分子遗传学方法。该方法在许多领域如细胞周期调控、信号转导、肿瘤基因表达等中已有成功应用,现已成为功能基因组和蛋白质组研究的一种有用工具。迄今,已有近对新的蛋白相互作用通过酵母双杂交系统确定。因此,本研究利用酵母双杂交系统筛选与胞蛋白,并对部分基因进行验证和初步功能分析。薹;文分以下五个部分进行总结。第一部分欠衲艹晌=湍杆咏幌低车囊桓鍪屎系挠斩鞍住方法将蟹肿涌寺。菇ㄓ斩柿甐:用乙酸锂法将转化酵母菌煌ü硇图ā法验证质粒导入宿主菌对于柯萨奇病毒感染尚无良策,⒚挥型卣怪聊肯赴诓俊W莨跜恼鲈鲋持芷冢琕自病毒感染细胞后一直存在于细胞内。在分子水平上,谒拗飨赴谌绾斡胂赴白相互作用从而参与对细胞的致病机制仍不清楚。苯酉嗷プ饔玫乃拗飨目的检测验证鞍椎谋泶铮蝗缓缶Q毕菖嘌兔傅孜颴.Ⅱ一后,上海第二医科大学博士学位论文博士研究生:黄孝天上海第二医科大学病原生物学教研室导师:刘晶星
最后经小规模配合试验检测鞍锥粤街纸慌湫徒湍妇呐浜瞎δ苡跋臁结果限制性内切酶酶切和序列分析表明瘸晒Σ迦雙靥宓亩结论白钥勺魑=湍杆咏幌低车挠斩鞍祝屎嫌谙乱徊降大规模文库筛选。第二部分筛选与苯幼饔玫南赴鞍方法大规模酵母配合法筛选人心脏文库;经阳性克隆的表型确定、┰鰁迦肫魏虯盖械仁匝榻粜钥寺」槔啵⒔胁庑蚝屯源性比对分析;话肴樘擒彰付糠治鯲与各阳性蛋白之间相互作用的强弱。S斩鞍祝尤诵脑鄀目庵猩秆〉鲅粜克隆:通过初步分析粜钥寺〉谋硇腿范ā扩增插入片段和酶切等试验鲅粜钥寺》治类;经测序和同源性比对,最后共获得种不同类别的克隆:寺∥狹装配因子珹克隆为寺∥狿视网膜结构氢酶亚单位唤秆〉腉:;伍一半乳糖营酶定量分析试验进结论本部分研究成功地运用了大规模酵母配合法。以白,从人心脏文库中获得植煌啾鸬难粜曰颍篗、、反应检测蚨种报告基因蚆的转录自激活作用;克隆位点,阅读框与病毒蛞恢拢槐硇图ê,证实鼙泶颲蛋白;营养缺陷型培养基和酶底物颍瓽反应结果显示鞍锥种报告基因均无转录自激活作用;小规模配合试验明确了鞍自贏的表达基本不影响其正常的配合功能。目的以S斩鞍祝赋鲇隒直接作用的人心脏文库基因,并对阳性克隆进行初步分析和鉴定。结果以叨寤实鞍譍珹域蛋白珹克隆为结构域结合蛋白,寺∥狽新序列提交给库,获得一步证明了蚅个基因