文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
Cbfa1全长cDNA的克隆及其对成纤维细胞软骨相关基因表达的影
响
姓名:张伟
申请学位级别:硕士
专业:外科学(骨科)
指导教师:邓廉夫
20040401
ǔ目寺〖捌涠猿上宋赴砉窍喙鼗虮达的影响摘要:具有结构域的枪欠⑸统晒窍赴只蟹浅9丶淖B家蜃印最近研究发现斡肓朔蚀笕砉窍赴姆只NA烁徊搅私釩在软骨发生中的作用,我们研究了猿上宋赴腥砉窍喙鼗虮泶锏挠跋臁首先,应用技术,直接从天胎鼠肢芽细胞中克隆出疪全长,ê托蛄蟹治证实了克隆的正确性。∈笃し舫上宋胞中,小时后收集细胞并用检测疪的表达情况,结果显示疪获得表达;。在构建出婧吮泶镌靥搴螅渥;匠上宋赴小时后比较转染组和未转染组中型胶原的表达。结果显示疪在成纤维细胞中的高表达能提高和型胶原的表达,但疪在成纤维细胞中的高表达对和的表达没有影响。关键词:疪;克隆;成纤维细胞:基因表达中,小时后比较转染组和未转染组、和的转录表达情况,上海第二医科大学级硕士毕业论文
一一一兰塑塑三垦型查堂堑婴圭望堡塞.,—:—,瑆..瑄疪.....籆/瓵琧..疪,..籆/.、甊,.篊/籧;;,
第一部分ǔ目寺〖,因此也叫着W罱芯糠⑾疪在成骨细胞系的分化中起着关键的调控作用,靶向敲除虻膔峁褂蚩傻贾滦∈笪薹ㄐ纬赏暾墓趋老低常晒窍赴某墒过程停滞H薈/虻囊桓鲈雍闲酝槐湟彩堑贾滤峭仿⒂良的原因,。疪转录因子复合物能结合到与成骨细胞发育有关基因的顺式作用元件上,从而调控成骨细胞的生长和分化T诒狙芯恐形颐侵接从天胎鼠肢芽细胞中克隆到疪基因,将其构建到高效的表达载体,并观察到疪基因在成纤维细胞中的表达。:,鹤訥公司;.靥澹琒孀B济福瑃琹为产品:为产品:酶购自大连宝生物:用腹鹤訮;蚗狽产品:质粒抽提试剂盒购自上海生工:胶回收试剂盒和无内毒素质粒大抽试剂盒为公司产品;其它试剂为国产分析纯:引物由上海生工合成。.笛橐瞧基因分析仪高速离心机上海第二医科大学级硕士毕业论文
最后用无傅乃芙釸,紫外分光光度计上测定其浓度。用甲根据中疪的阅读框架分别在起始密码子和终止密码孵育器仪小型台式离心机超净工作台电泳仪正嘌细菌培养箱虾>ê∈笾吭,加入霞羲椤J椅路胖分钟,再加入氯仿,盖紧盖子,用手使劲晃动管秒钟,然后室温静置种印=酚离心分钟。胄耐旰蠡旌衔锉环治H悖R粕喜闼嗟揭桓鲂碌腅苤小<异戊醇到水相以沉淀J椅戮仓种樱缓笥离心分钟。离心完毕可以在管底见胶样透明沉淀,即恋怼5沟羯锨濉尤雔%酒精,于震荡器上充分混匀,然后于胄分钟。倒掉上清,于室温晾干,但注意不可让耆ǜ赏福悦釸难以溶解。醛琼脂糖凝胶电泳评估柿俊扩增子段的两侧设计扩增引物,并在上游引物上加入盖形坏悖掠我锛尤酶位点物序列分别为逆转录反应体系为:切引总上海第二医科大学级硕士毕业论文.’’:,
圭塑苎三垦型查堂塑兰堕型型型坚垒垦————————————一痷加水至,反应分钟。从μ逑滴#逆转录产物总体积为诽跫#湫个循环扩增产物由琼脂糖凝胶电泳检测反应结果。.┰霾锘厥电泳完毕在紫外分析仪下检测,阳性条带用厥眨方法如下:玫镀钕潞粜蕴醮慕骸迫〗禾踔亓浚尤倍的缓冲液。疨℃×。
苯和耆诨觳榛旌衔锸欠裎;粕ā玅臃沤桓的收集管中。缓冲液到柱子膜上,离心种樱艘杭次4炕玫拿掠种樱菇和耆诨尤倍胶量的异丙醇混匀。玅臃湃的收集管中。芳拥絈又胄分钟。,,。.加缓冲液到柱子膜上离心种樱艘杭次;厥盏腄。.#撼逡总体积℃酶切∈薄酶切产物用炕4炕椒ㄎ#倍体积缓冲液与酶切产物混合。ɑ旌弦杭咏又校胄分钟。,离心种印沟舴弦海臃呕厥占苤校胄分钟。臃沤桓鲂碌睦胄墓苤小上海第二医科大学级硕士毕业论文
占苤械姆弦海玹呕厥占苤校切片段。.=陨洗炕镆比例混合,用连接过夜。连接反应体系为:;连接产物需转化到大肠杆菌感受态细胞中经过甃剐云桨迳秆 W化步骤如下:玪硬镉氪蟪Ω司鶧惺芴赴煸龋戏胖种印热激秒,然后冰上放种印觢培养基到离心管中,水浴中振荡培养∈薄赴坎加谟蠥‘抗性的平板上,。嘌∈,。浴摇菌过夜。,方法如下:菌液离心