文档介绍：郑州大学
博士学位论文
P02基因的全长cDNA克隆及其过表达对肝细胞株生物学行为的影
响
姓名:高天慧
申请学位级别:博士
专业:消化内科
指导教师:段芳龄

及其过表达对肝细胞株生物学行为的影响虻娜ǔ寺兰里堂皇兰二竺兰墨竺兰兰兰兰兰苎美锢祭祭祭嫉三摘要竺竺查兰垦兰兰竺竺至兰兰竺兰兰导师:,很可能是肝细胞表达状态,而且这种高表达在肝细胞癌组织中具有普遍性。葱苑治觯⑾炙与基因高度同源。研究表明,在哺乳动物基因组内存在着大量的净虻募倩促进生长的作用,最近,有学者报道了该基因的抗凋亡作用和阻断该基因对肿瘤细胞株恶较来源于正常组织的细胞系有更强的表达,睦丛幢尘耙约八耐蠢嗨莆锏难芯结果,都强烈提示:;。痈蜗赴┳橹锌寺的琌胝婧吮ǜ姹泶镌靥錺—,构成新的研究生:高天慧琀±窃癌发生、发展的原因。抑制性消减杂交是获得差异表达基因的快速、有效而且灵敏的方法,泶镄蛄斜昵和—治鲋な礟在肝细胞癌中呈高甌。最初的研究表明,有分析显示的高度同源类似在癌细胞系似物高表达导致肿瘤发生、发展的直接证据。为了验证这个推测,为肝细胞癌寻找新的致病基因和治疗靶点,本实验拟以全长,分析肝细胞癌中是否存在募倩蚝屯槐浠颉=玃全长目放读码框目的与背景临床上大多数肝细胞癌瓻褪俏颐峭ü愿蜗赴┖透斡不橹蠸得的在懈弑泶锏幕颍琋因,而且这些假基因也表现出一定程度的转录活性。的蛋白产物为翻译控制的蛋白性表型的逆转作用,质
狽重构体,并将此重构体分别转导入肝癌细胞系驼8蜗赴蛄’末端的峁购汀癆从钡募游残藕牛撇釶序的隹寺〗行蛄蟹謢斤冉闲蛄兄溆蟹癫钜欤⑺阉饔蒵’所得的序列与已涞慕坏蛄校觠’所得的序列中去除这段重叠序列后,与已知的氖侗鹦蛄卸涠ㄏ虿迦氪新躺ü獾鞍准是┑恼婧吮ǜ姹泶镌靥錺—分别转染肝癌细胞系一和正常肝细胞系,在小时内连续转染危宰H緋—南赴J笛樽椋宰H緋南赴6哉兆椋谟锎笮≡左右,从疪镌贓序列中的位置,至蛄械’末端由贤ㄓ靡锏某ざ龋苍左右,根据已知的┒撕屑游残藕藕蚿结构,从而判定该蛄泻’】赴瞪镅形5挠跋臁’末端,并据此设计引物,通过逆转录酶在┒说哪0遄;换.,┳橹欣┰鯬的’末端,,随机挑取隹寺。眉盍呀夥ㄌ崛≈柿#兔盖屑康钠蔚牟迦耄盟蜒趿茨┒酥罩狗ń兴虿庑颍ú庑蚪峁谙呷砑赋蛄辛讲嗨牟锰逍蛄泻屯饧咏油沸蛄校肂对随机测唇樱軰规则,判定该拼接序列是否符合全长的特点,用在兴阉鱌全长的同源序列,生物软件预测膐,以及蛋白产物的结构、功能、亚细胞定位和理化性质。通过姆椒ㄔ赑迦胱拥闹毓固錺—敲顾厣秆⊙粜钥寺。盍呀法抽提质粒,双酶切和ḿ康钠蔚牟迦耄甋ú庑颍琕和治霾庑蚪峁康钠蔚恼凡迦包括插入方向、插入部位和插入序列的正确无误用超纯质粒抽提试剂盒抽提蚿—.通过光显微镜下通过绿色荧光标签观察泶锏鞍自诟蜗迪赴诘难窍赴ㄎ唬嗖獗达效率,通过—实验、软琼脂克隆形成实验、细胞周期分析,比较转染狽的实验组与转染狽亩哉兆橹涞牟畋稹结果蛄方法根据手讲嗵砑覧和中钩珊蠵╥知的蹵筇州大学医学既年博士研究生学位论虻纳嘶绥黾捌鋘舞迂对轩纽瞻摊生物学芪5牟氏
型查塑兰堕竺饕铙盟芗竺兰里竺后皿皿媚靡铙皿皿皿靡钏芩后,通过兔盖械姆椒ǘ即友粜钥寺〉闹柿V械玫搅左右的片段,随机挑取疪┰析表明,它与的全长序列高度同源。娜ǔ蛄幸训萁恢罣,是一个非信号肽、非线粒体靶向肽、非跨膜的蛋白质,其第位的天冬酰氨酸可能是一个腔坏悖糖基化位点,第弧弧弧凰堪彼幔凰瞻危盖泻螅刖盖械膒—,从卡那霉素筛选的阳性克隆中,建体的正确性,用此重构体转导后,在荧光显微镜下,可见细胞发出明亮的绿色荧光,在细胞核所在的区域,荧光强度明显减弱,而狽5嫉亩哉兆橄赴虺氏治C稚⒌穆躺与转染狽亩哉兆橄啾龋擅飨栽銮扛伟┫赴档脑鲋衬芰腿砬碇寺⌒纬赡的平板克隆形成能力,不能使正常肝细胞系在软琼脂中形成克隆。结论首次从肝细胞癌组织中克隆出娜ǔ蛄校眯蛄谐,已被递交至=邮芎盼狝T诟蜗赴┳橹形捶⑾諴的突变体和假基因。治霰砻鳎琍的全长与基因高度同源。生物软件预测:个碱基,编码霭被帷1嗦肭挥谌ǔ蛄械膌解酶,属于生长因子类,它是~个非信号肽、非线粒体靶向肽、非跨膜的蛋白质。进一步克隆和测序。疪锎笮≡左右,该序列克隆入—靥的隹寺〔庑虻慕峁砻鳌@醋个克隆的序列之间不存在变异。将的序列,该序列符合嬖颍珺分的个碱基,编码霭被幔嗦肭挥谌ǔ序列的位核苷酸。编码蛋白的分子量为鹊绲阄.;蛋白质结构和功能预测提示:该蛋白是一个位于细胞胞膜的裂解酶,属于生长因子类,它酸,第位和位酪氨酸是潜在的磷酸化位