文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
GDNF基因修饰雪旺氏细胞修复周围神经缺损的实验研究
姓名:平萍
申请学位级别:博士
专业:外科学,整复外科
指导教师:张涤生

本文英文缩略词表脑源性神经营养因子牛垂体提取液睫状神经营养因子杜氏改良依格培养基胶质细胞源性神经营「春隙鞯缥振幅碱性成纤维细胞生长神经传导速度神经生长因子磷酸盐缓冲液雪旺氏细胞养因子因子疭痵—
基因修饰雪旺氏细胞修复周围神经缺损的实验研究展√已有大量研究表明:胶质细胞源性神经营养因子中文摘要周围神经损伤修复是临床治疗中的一个难题。旧前临床治疗主要采用直痉椒ā恳孕律天大鼠的坐骨神经为材料,参照文献设计特异性元具有很强的营养和支持存活作用:而雪旺氏细胞作为周围神经系统中唯一果,寻找一种修复周围神经损伤的有效方法。\上、下游引物,用—椒ê铣蒅碇堑缬局な蹈闷未小在之间,回收该危肨连接酶将其连接入通用载逆转录病毒载体经接端端吻合或自体神经移植。基础研究方面研究方向较多,但仍无突破性进,栽硕⒏芯酢⒔桓屑安糠种惺嗌窬的结构和功能细胞,对再生轴突具有营养、趋化和接触引导作用。任本研究中,我们将基因导入雪旺氏细胞内,再将此基因修饰细胞植入神经导管内修复大鼠周围神经缺损,旨在借助分子生物学新技术,结合以往的研究成体—小S昧臃从σ鹤H靖惺芴妇粞】剐钥寺。┰觥⒅柿抽提、盖泻蟮缬炯ǎな悼寺〕晒螅柿K筒庑颍该片段与文献报道“一致,无碱基突变。盖泻蟮缬荆厥眨肨接酶将双酶切后的连接入中。将连接反应液转染感受态细菌,挑选抗性克隆,经扩增、质粒抽提、蚐盖校缬炯ㄖ实克隆成功后,大量扩增抽提重组质粒S弥侍宸ń刈橹粒转染包装细胞,经筛选后,挑出生长良好的抗性克隆,扩增培养并收集代病毒上清。将收集的病毒上清感染成纤维细胞’,经含蚐儿一博士学位论文,
的培养基筛选约天,未转染细胞已死亡,转染成功的细胞则不断增殖形成去除其中的成纤维细胞,细胞贴壁后换用含阿糖胞苷的培养基进一步去除成胞约∈保缓蟛钩涞攘颗嘌骸7直鹗占×幕蛐奘窝┩蛋白含量进行检测。为了解外源性基因产物是否具有生物学活性,我们用转染细胞和未转染细胞的无血清条件培养基对大鼠皮层运动神经元进行培养,离断后,造成的缺损,用硅胶管桥接缺损,管腔内分别注入基因修饰雪旺氏细胞及正常雪旺氏细胞,单纯硅胶管修复组作为对照。分别于术后、图象分析测量再生有髓神经纤维的密度和总数,髓鞘厚度等评价修复效果。抗性克隆。通过计数抗性克隆数算出病毒液的滴度,。无菌条件下取新生大鼠的坐骨神经,剪碎、酶消化,经血清中和、溶液清洗,用少量培养基重悬细胞后接种于培养皿内。经尾钏偬谝纤维细胞。转染前,用含牛脑垂体浸出液的培养基培养数日以刺激细胞有丝分裂。待细胞达到—%融合时,在病毒液中加入H狙┩舷氏细胞猄罢O赴,用—ɑ袢×街窒赴腉电泳比较两者表达量的差别。将基因修饰雪旺氏细胞及正常雪旺氏细胞消化下来,接种于载玻片上,用抗抗体对二者进行免疫组化检测,比较蛋白在细胞内的表达。为检测转染细胞和未转染细胞分泌蛋白的差异,我们用约梁卸宰H鞠赴臀醋H鞠赴奈扪G逄跫嘌械腉运用椒ḿ觳飧髯橄赴纳锘钚浴只成年大鼠,随机分为椋孔弧=ù笫蟮淖巧窬、周对各组动物进行一般观察,肌电图测量,组织学切片观察与计算机τ肦狿方法对—癝检测发现表达的水平明显优于免疫组化检测发现抗染色呈强阳性,嗜跹粜裕ḿ觳饨峁咀H竞周—【结果】博士学位论文
胶管组2一旺氏细胞植入硅胶神经导管内修复大鼠坐骨神经缺损,;猄组动物的神经传导速度,有髓神经纤维密度,神经组织面积,髓鞘厚度均显著性优于楹凸【结论】经重组质粒一转染的雪旺氏细胞可表达、分泌具有生物活性的蛋白,其分泌水平明显优于未转染雪旺氏细胞。用该基因修饰雪旺氏细胞。该方法可能成为治疗周围神经损伤的颇具应用前景的基因疗法。【关键词】周围神经再生胶质细胞源性神经营养因子基因治疗雪旺氏细胞博士擘位论文
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代,随着显微外科技术在周围神经损伤治疗中的应用,各种修复和康复治疗的神经移植等治疗原则及方法的应用,周围神经损伤修复的疗效有了明显提高。但是,目前周围神经损伤修复后功能恢复仍欠理想。因为周围神经损伤实质上属于细胞损伤,出生后神经元不能分裂,神经元受损后的再生只能依即使再生轴突能抵达末梢,也只能重建部分突触联系,神经功能恢复自然大泛应用,周围神经再生的基础研究有了长足的进步,已步入了细胞、分子水平。通过对周围神经再生微环境的研究,雪旺氏细胞的功能和其分泌的促神经生长活性物质的研究,二十余种神经营养因子的