文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
锤头状核酶的活性鉴定与抗凋亡作用研究
姓名:张(韦华)
申请学位级别:博士
专业:内科学(传染病)
指导教师:周霞秋
20040401
锤头状核酶的活性鉴定与抗凋亡作用研究上海第⒖拼笱Т率垦Х蘼畚中文摘要细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制,是许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。细胞凋亡可以被多种生理性和病理性因素所诱发。近年研究表明,肝细胞凋亡是许多肝脏疾病病理损伤的重要机制之一,如病毒性肝炎、Ⅳ痵瘸、酒精性肝病、内毒衡起关键作用。鞍酌讣易宓姆蠛蠡罨诘蛲鍪奠竿瓿晒讨衅改变,可见凋亡的肝细胞出现皱缩、核仁消失、染色质浓聚、断裂、边集索血症引起的肝衰竭及缺血再灌注性肝损伤等疾病的病理损伤中都能够找到肝细胞凋亡发生的依据。肝细胞凋亡和肝纤维化是许多慢性肝病肝脏损伤的两个主要冈索。在各种肝病患者的血清中,可溶性癟一Ⅱ的水平都会明显升高,肝细胞表面又有、猂蚑等死亡受体的表达,由它们所介导的肝细胞凋亡可能对调节肝细胞动态平着关键作用。无论是经过传导的细胞外信号通路,还是由介导的线粒体途径,或是由榈嫉哪谥释ぃ终都在效』监愫稀R阎;迥诓皇实钡拿灏蛲隹梢缘贾露嘀疾病状态的发生发展,作为“捌亡效应蛋白”的和自然会成为这些疾病治疗的新靶点。核酶琑是一类独特的分子,具有自我剪仞和催化活性。其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶呋呀獍蠷,‘以抑制基网表达,特别是抑制有害基因的表达。核酶在攮因治疗领域具有广阔的应用前景。本课题分别研究了抗和抗锤头状核酶在细胞内、外的切割活性及它们对。猘和放线菌素盏嫉男∈笤蜗赴蛲龅淖枰肿饔谩本研究共分为三个部分。头畔呔谼协同诱导原代小鼠肝细胞凋亡的研究。通过荧光染色及透射电镜观察细胞形态学第一部分是对外源性加入的
上游勇江压科大学搏士学忿≠含冀在核膜周围,并有凋亡小体形成。碇悄旱缬究杉狭训腄产生蚉旧ǎü魇较赴羌觳庖┪镒饔貌玜和放线菌素男饔媚芄淮碳—和猚此,体外筛选结果是抗锤头状核酶涂笴一竿在原代肝细胞内对靶基因的切割活性。以绿色荧光蛋白基因为报告基因构鞍椎谋泶铮徊⑼ü魇较赴羌际鹾虳琼脂糖凝胶同时间点的细胞凋亡率,结果出现随着药物作用时间的延长而逐渐增加的细胞凋亡率。分别通过—际鹾蚖免疫印记法对效应和的及蛋白表达进行检测。—峁允荆琓—头线菌素男饔媚芄淮碳一虲一泶铮宜孀作用时问的延长而显著升高,免疫印记检测的结果显示,蛋白的翻译和活化,促进猚那懈罨罨1湮;罨问降直鹕杓撇⒑铣闪个特异性的锤头状核酶的编码过分子克隆技术将核酶编码基因克隆到小Mü孀B季酆厦链反应狿┰龀鯟和基因片段,将其克隆到—靥宀罚ü逋庾B蓟竦煤嗣负桶蠷,并通过体外切割试验筛选出在体外能够高效、特异地催化切割的锤头状核酶。体外切割试验显示匾煨郧懈畹孜锊和危懈钚式系停鲇ィ籖切割产生片段,切割效率为.%:荒芮懈畹孜铩R状核酶谔逋饩哂懈咝А⑻匾斓那懈罨钚浴建核酶真核表达质粒疪ü爸侍褰柿/转染入体外培养的原代小鼠肝细胞中,通过—觳夂嗣缸H厩昂驝一的表达;通过庖哂〖羌觳釶—和明显的“梯带”。在第二部分,我们针对/∈蟮牡蛲龅鞍酌窩一产生片段,切割效率为.%;懈頒一第三部分是研究抗核酶涂笴一嗣窻和。.
上海剪箍拼笱Р┦垦Ю畚电泳研究核酶转染后对猳和放线菌素盏嫉母蜗赴蛲龅淖枰肿用。结果显示,在相同浓度的猶和放线菌素男饔孟拢H竞的表达总之,外源性猲可以通过死亡受体途径诱导原代小鼠肝细胞发生的表达及蛋白酶原的翻译,引起酶原的活化,执行细胞凋在体外具柯高效、特异的催化切割活性,它们在细胞内也能够表现出较高关键词:细胞凋亡:死亡受体;原代肘细胞:核酶:半胱氨酸蛋白酶酶橄赴胛醋H竞嗣缸凋亡组啾龋珻一水平显著下降了.%,蛋白含量也比凋亡组降低了.%.赴蛲雎始醯土ィ珼“梯带”显著改善;转了.%.琍—蛋白含量显著减少了.%.细胞凋亡率降低了ィ珼“梯带”虽有所改善,但仍可见。掏亡,引起染色质断裂、疤荽毙纬桑⒋碳は赴贑一的切割可以在一定程度种艭蛋白酶原翻译和括化,延缓绌胞捌亡的发展进程,尤以抗核酶的作用更显著,剥治疗或减轻凋亡相关性肝病的肝组织损伤一以起到一定的作用。染核酶橄赴胛醋H咀橄啾龋珻一的表达也明显下降亡;针对杓频暮嗣窻和针对杓频暮嗣窻的催化活性,并通过对/.
上海第拼笱Р空扑侔’甒..琑琫猧/猧猂疶·,,—甊,,‘琲琓—瑃—.瑆.,.,ⅲ籩,瓹虎騛,.
.痾淳移娇拼笱Р垦У芈畚.——瓹瓵,..琣琣.%,ィ甊,.%.痵—.—,玠琣琧一猠,一瓹一’琁,產.,..
上海第娇拼笱Р空扑职猻;..,.%,.%..%ィ%琭猚.,;;;..%.,虎騝.—.
上海第娇拼笱Р┦垦Х蘼畚索血症引起的肝衰竭及缺血再灌注性肝损伤等疾病的病理损伤中都能够找榈嫉哪谥释ぃ钪斩荚