文档介绍：闽北职业技术学院食品与生物工程系
学****目标
1、掌握HPLC的分离原理、高效液相色谱分析的样品处理方法、分离方式的选择和定量分析方法及HPLC实验技术。
2、了解高效液相色谱仪的构造、仪器各部分的功用及仪器的维护和保养,熟悉其工作过程及常用固定相及流动相的特性及选用原则。
High Performance Liquid Chromatography
高效液相色谱分析法
闽北职业技术学院食品与生物工程系
一、液相色谱分离原理
特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。
液体待检测物被注入色谱柱,通过流动相推动,在固定相中移动,由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同,不同的物质以不同的顺序离开色谱柱,通过检测器得到不同的峰信号,最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
第一节高效液相色谱分离的原理
1、液相色谱分析法
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2、液相色谱法分类
1)液-液分配色谱法(LLC)
2)液-固吸附色谱法(LSC)
3)离子交换色谱法(IC)
4)空间排阻(凝胶)色谱法
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1)液-液分配色谱法(LLC)
分离机制:利用组分在两相中溶解度的差异实现分离。
固定相: 载体+固定液(物理或机械涂渍法)。
缺点:系统内部压力大,易流失,不实用。
极性固定液→NLLC,非极性固定液→RLLC
正相色谱——固定液极性> 流动相极性(NLLC),极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱, 适于分离极性组分。
反相色谱——固定液极性< 流动相极性(RLLC), 极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱,适于分离非极性组分。
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2)液-固吸附色谱法(LSC)
流动相为液体,固定相为固体吸附剂。
分离机制:利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异实现分离。
3)离子交换色谱法(IC)
分离机制:离子交换树脂上可交换的离子基团与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换,依据其对离子交换树脂上的固定离子基团亲和力的不同而将溶质分子分离。
离子对试剂:烷基磺酸钠→分析碱; 四丁基季***盐→分析酸
4)空间排阻(凝胶)色谱法
以凝胶为固定相的色谱法。
分离机制:溶质自身体积大小不同,透过凝胶的速率不等。
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高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别,它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相,适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
高效液相色谱也叫高压液相色谱(high pressure liquid chromatography)、高速液相色谱(high speed liquid chromatography)、高分离度液相色谱(high resolution liquid chromatography)等。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。
二、高效液相色谱分析法的特点
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1、高效液相色谱的特点
高压——压力可达150~300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——~ mL/min。
高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——。同时消耗样品少。
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2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点
速度快——通常分析一个样品在15~30 min,有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高——,。
色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少,容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分或做制备。
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三、HPL