文档介绍：cDNA测序和表达谱研究
一、cDNA测序
cDNA:与信使RNA互补的DNA,代表了基因的生物学信息。
基因:约占总序列的3%-5%
1991年,Venter等:
提出大规模cDNA测序研究战略
建立了表达序列标签(expressed sequence tag,EST)技术。
EST:
长度为300~500bp的部分cDNA
对人类基因转录图的制作、全长基因的克隆、基因表达谱的研究等有重要作用。
公共数据库GenBank(.gov/dbEST)
UniGene:
为了弄清EST间的关系,美国国立生物技术信息中心(NCBl)根据EST相似性比较进行聚类分析,形成数据库UniGene (.gov/UniGene)
当前cDNA测序的趋势:
由对EST的随机测序,
转向全长cDNA的克隆和测序。
全长cDNA
是功能基因组学和比较基因组学研究的基础,
有功能意义的全长cDNA可以申请专利,
因此,除研究部门外,大药厂和生物技术公司也投入重金进行研究和抢占专利。
目前大部分的全长基因有待于克隆。
随着人类基因组DNA测序的快速进展,众多EST可供利用,生物信息学手段的增多和cDNA文库构建技术的完善,使得能够获得转录物较长的全长cDNA和低转录基因。
目前,美国NIH启动了全长cDNA计划—哺乳动物基因采集计划(Mammalian Gene Collection Project) ,加之其他国家的加入,大大加快了全长cDNA的识别和克隆工作。
中国的人类基因组计划起步较晚,但坚持“有所为,有所不为”的原则,充分利用自己的资源优势和研究基础,提出对特殊组织如造血细胞、神经内分泌细胞、树突状细胞、胚胎器官等,或疾病如白血病、肝癌等进行大规模EST测序,进行基因表达谱分析,同时完成1%人类全长cDNA的识别和克隆任务。
(一)大规模EST测序流程
并非简单个别cDNA测序的累加,
是现代生物技术和现代管理方法的结合,
是生物学与计算机科学的结合。
大规模EST测序:
多采用流水线作业及计算机辅助管理系统。
主要步骤:
1)cDNA文库构建
2)DNA测序
3)信息处理和管理
4)生物信息学分析
1. cDNA文库构建
研究目的不同—采用不同的cDNA文库构建方法。
①表达谱分析:常规的cDNA文库,如:oligo-dT引物定向克隆cDNA文库或随机引物法构建cDNA文库;
②获得更多的全长cDNA:构建全长cDNA文库,如:smart-PCR和oligo-PCR;
③增加EST种类:均一化(normalized)cDNA文库;
④克隆不同状态(药物处理的不同时相、不同病理及疾病的不同发展阶段等)的相关基因:减式cDNA文库构建方法。
(1)oligo-dT引物定向克隆cDNA文库
最常用、大多数cDNA文库构建的方法;
多数EST来自该文库。
主要步骤:
RNA和mRNA抽提,
以mRNA为模板用oligo-dT作反转录引物合成
cDNA第一链,
在DNA聚合酶I作用下合成第二链,
加上接头后定向装入λ噬菌体。
(2)CapFinder-PCR/oligo-PCR文库
主要特点:
利用mRNA 5’帽状结构设计引物,
该引物含有oligo(G)以对应于帽状结构的脱氧胞嘧啶,反转录反应时易于合成含有全长的第一链cDNA,
用5’和3’引物(oligo-dT)进行PCR扩增获得双链DNA,
装入λ噬菌体。
该种文库含有较高比例的全长cDNA,
也适于样本量较少的组织构建cDNA文库。