文档介绍：γ-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用的研究
广东药学院
硕士学位论文
γ-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用研究
姓名蒋敏丽
申请学位级别硕士
专业病原生物学
指导教师胡立勇
2011-05
广东药学院硕士研究生学位论文
-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用研究
中文摘要
-谷氨酰转肽酶在生物体内广泛存在是谷胱甘肽代谢的关键酶之一随着生物
技术发展的快速发展利用-谷氨酰转肽酶制备系列-谷氨酰基类化合物的研究已成
为生物催化领域的热点目前本实验室筛选到一株-谷氨酰转肽酶高产菌株并已
探索了以菌体作为酶源催化合成茶氨酸的生产工艺在此基础上我们作了进一步的
研究
目的
以Bacillus licheniformis C12 菌株为-谷氨酰转肽酶制备的菌种来源通过对其产
酶发酵条件优化提取工艺酶学性质及固定化该酶催化底物生产茶氨酸进行系统研
究为固定化该酶工业化生产茶氨酸打下基础
方法
1 产酶发酵的诱导条件研究采用底物诱导作用通过不同底物甘氨酸谷氨
酸谷氨酰***对菌体产酶发酵进行诱导提高菌体的产酶量
2 酶的提取及酶学性质研究采用溶菌酶法反复冻融法超声波法破碎细胞壁
高速冷冻离心后获得-谷氨酰转肽酶粗酶液经硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化
后得到酶的提取物采用-谷氨酰转肽酶常规测定方法检测其酶学性质
3 固定化酶制备及催化条件研究采用海藻酸钠包埋戊二醛交联法制备固定化
酶通过正交试验对固定化酶条件进行优化通过采取调整底物浓度反应温度
pH 以及添加酶促进剂提高固定化酶催化生产茶氨酸量并采用正交试验得到最
佳的固定化酶催化生产茶氨酸的工艺条件
结果
1 产酶发酵的诱导条件研究产酶发酵24h 后添加谷氨酰***至浓度5mmolL诱
导2h 后其酶活力最高为70Uml是对照组的226 倍
2 酶提取及酶学性质研究菌体细胞破碎的较佳方法为溶菌酶破碎法其操作条
件选择为每克湿菌体加入25mg 溶菌酶35℃酶解20min 冷冻离心得粗酶液再经
I
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过 80-90饱和度的硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后得到酶的提取物该酶
的最适pH 为80最适温度为45℃-谷氨酰转肽酶的转肽反应Km 为073mmolL
该酶在25-35℃的温度范围有较好的稳定性在50℃的温度下保存20min 酶活力基本
丧失该酶在碱性环境中比较稳定酸性环境中很容易失活在Ba2 Mg2 Ca2等
金属离子浓度为5mmolL 的情况下对该酶的活力均有促进作用
3 固定化酶制备及催化条件研究①固定化酶制备方法采用海藻酸钠包埋戊
二醛交联法取一定量的酶提取物添加含量30的海藻酸钠包埋再添加025戊
二醛进行交联交联时间25h制备得到的固定化酶酶活回收率为708 固定化酶
的最适pH 为90与游离酶相比向酸性方向偏移10 个单位固定化酶的最适温度为
37℃比游离酶最适温度降低了8 ℃-谷氨酰转肽酶经固定化后热稳定性酸碱
稳定性和贮存稳定性都得到了提高②固定化酶催化条件研究了Mg2及16-二磷酸
果糖FDP 发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的作用通过正交试验确定 Mg2
及 16-二磷酸果糖FDP 发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的较佳条件为 20ml
FDP 发酵液30ml 转化液以及Mg2浓度为30mmolL在此条件下固定化酶转化合成
茶氨酸量为95gL 相比对照组61 gL 提高了557固定化酶生产茶氨酸的操作稳
定性比较差反应九批次后茶氨酸产量只有首批次的311
结论
本研究优化了产酶发酵条件初步建立了来源于Bacillus licheniformis C12 菌株的
-谷氨酰转肽酶的提取纯化方法及了解了该酶的部分酶学性质采用海藻酸钠包埋戊
二醛交联法制备固定化-谷氨酰转肽酶可用于生产茶氨酸固定化酶酶活力与操
作稳定性还有待进一步提高
关键词-谷氨酰转肽酶酶学性质固定化酶茶氨酸
II
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参考文献
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