文档介绍：广东药学院
硕士学位论文
γ-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用研究
姓名:蒋敏丽
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:胡立勇
2011-05
广东药学院硕士研究生学位论文
?-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用研究
中文摘要
?-谷氨酰转肽酶在生物体内广泛存在,是谷胱甘肽代谢的关键酶之一, 随着生物
技术发展的快速发展,利用?-谷氨酰转肽酶制备系列?-谷氨酰基类化合物的研究已成
为生物催化领域的热点。目前,本实验室筛选到一株?-谷氨酰转肽酶高产菌株,并已
探索了以菌体作为酶源催化合成茶氨酸的生产工艺。在此基础上,我们作了进一步的
研究。
目的
以 Bacillus licheniformis C12 菌株为?-谷氨酰转肽酶制备的菌种来源,通过对其产
酶发酵条件优化、提取工艺、酶学性质及固定化该酶催化底物生产茶氨酸进行系统研
究,为固定化该酶工业化生产茶氨酸打下基础。
方法
1. 产酶发酵的诱导条件研究:采用底物诱导作用,通过不同底物(甘氨酸、谷氨
酸、谷氨酰***)对菌体产酶发酵进行诱导,提高菌体的产酶量。
2. 酶的提取及酶学性质研究:采用溶菌酶法、反复冻融法、超声波法破碎细胞壁,
高速冷冻离心后获得?-谷氨酰转肽酶粗酶液,经硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化
后,得到酶的提取物。采用?-谷氨酰转肽酶常规测定方法检测其酶学性质。
3. 固定化酶制备及催化条件研究:采用海藻酸钠包埋戊二醛交联法,制备固定化
酶,通过正交试验对固定化酶条件进行优化。通过采取调整底物浓度、反应温度、
pH 以及添加酶促进剂提高固定化酶催化生产茶氨酸量,并采用正交试验得到最
佳的固定化酶催化生产茶氨酸的工艺条件。
结果
1. 产酶发酵的诱导条件研究:产酶发酵 24h 后添加谷氨酰***至浓度 5mmol/L,诱
导 2h 后,其酶活力最高为 ,是对照组的 倍。
2. 酶提取及酶学性质研究:菌体细胞破碎的较佳方法为溶菌酶破碎法,其操作条
件选择为每克湿菌体加入 溶菌酶,35℃酶解 20min,冷冻离心得粗酶液。再经
I
广东药学院硕士研究生学位论文
过 80-90%饱和度的硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后,得到酶的提取物。该酶
的最适 pH 为 ,最适温度为 45℃,?-谷氨酰转肽酶的转肽反应 Km为 。
该酶在 25-35℃的温度范围有较好的稳定性,在 50℃的温度下保存 20min 酶活力基本
丧失。该酶在碱性环境中比较稳定,酸性环境中很容易失活。在 Ba2+,Mg2+,Ca2+等
金属离子浓度为 5mmol/L 的情况下,对该酶的活力均有促进作用。
3. 固定化酶制备及催化条件研究:①固定化酶制备方法:采用海藻酸钠包埋戊
二醛交联法,取一定量的酶提取物,添加含量 %的海藻酸钠包埋,再添加 %戊
二醛进行交联,交联时间 。制备得到的固定化酶酶活回收率为 %。固定化酶
的最适 pH 为 ,与游离酶相比向酸性方向偏移 个单位;固定化酶的最适温度为
37℃,比游离酶最适温度降低了 8 ℃。?-谷氨酰转肽酶经固定化后,热稳定性、酸碱
稳定性和贮存稳定性都得到了提高。②固定化酶催化条件:研究了 Mg2+及 1,6-二磷酸
果糖(FDP)发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的作用,通过正交试验确定 Mg2+
及 1,6-二磷酸果糖(FDP)发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的较佳条件为
FDP 发酵液/30ml 转化液以及 Mg2+浓度为 。在此条件下固定化酶转化合成
茶氨酸量为 ,相比对照组 g/L 提高了 %。固定化酶生产茶氨酸的操作稳
定性比较差,反应九批次后,茶氨酸产量只有首批次的 %。
结论
本研究优化了产酶发酵条件,初步建立了来源于 Bacillus licheniformis C12 菌株的
?-谷氨酰转肽酶的提取纯化方法及了解了该酶的部分酶学性质。采用海藻酸钠包埋戊
二醛交联法,制备固定化?-谷氨酰转肽酶,可用于生产茶氨酸。固定化酶酶活力与操
作稳定性还有待进一步提高。
关键词:?-谷氨酰转肽酶,酶学性质,固定化酶,茶氨酸。
II
广东药学院硕士研究生学位论文
参考文献
[1] Meister Alton,Suresh S Tate,Owen W G eriffitr.?-lutamyltranspeptidase[J].Methods in