文档介绍：一、荧光定量PCR技术(Quantitative real-time PCR, FQ-PCR)
荧光定量PCR是美国Perkin Elmer公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。
Cycle #
Theoretical
Real Life
Log Target DNA
常规PCR的局限性:
Amplification is exponential, but the exponential increase is limited:
1、为什么要发展定量PCR技术?
无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析
必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒
无法对扩增反应实时检测
Quantitative es from monitoring
the early stages of amplification.
Cycle #
Theoretical
Real Life
Log Target DNA
Detector
定量的最佳时期
2、如何进行定量?
定量的最佳时期是指数期
可是,我们如何知道PCR反应什么时候处在指数期、又如何进行检测呢?
实时定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每一个循环变得“可见”,最后通过Ct值和标准曲线对样品中的目的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。
Real-Time PCR
PCR仪+ 监测、分析系统+ 荧光标记
l
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l
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非特异性荧光标记:
SYBR Green
特异性荧光标记:
TaqMan
DNA产物的荧光标记
SYBR GreenⅠ工作原理
SYBR Green能结合到双链DNA的小沟部位
SYBR GreenⅠ只有和双链DNA结合后才发荧光
变性时,DNA双链分开,无荧光
复性和延伸时,形成双链DNA,SYBR GreenⅠ发荧光,在此阶段采集荧光信号。
SYBR Green
5’
3’
5’
3’
SG
No Emission
SG
SG
SG
Excitation
SG
SG
SG
SG
SG
SG
SG
5’
3’
5’
3’
Emission
Excitation
约 497 nm
约520 nm