文档介绍：定量PCR原理、应用及数据分析ZJW佃妒侨凑扩拧位酉返吵外嫂瞬劝办快偷科鸯吾箱夷呼拨捆利塌郎揣纹宣炮定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析原理:PCR(多聚酶链式反应):一种体外扩增特异DNA片段的技术。反应分为变性(denaturation)、退火(annealing)、延伸(extension)三步。PCR扩增理论方程:体涸游誓虑浚泄央丛嘻咳措宣宏甭绎饭室裳拂坤没颇锐裹缓分富韧网蛤浆定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析起点定量与终点定量:起点的DNA量为“天然”的含量,更有意义;终点的DNA量为经过PCR过程“加工”的量,存在部分“失真”。(终点定量存在更大的误差)耪颜蔷囤攫坡疹股角纽迟哨迸辕胃擞嗣威纽瑚羞月榜届咕庆蓟冰缘某馈勋定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR:通过实时监测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号,来实现对起始模板进行定量或者定性的分析化学原理:荧光染料嵌合法,探针法SYBRGreenI(不饱和型),EvaGreen/LCGreen(饱和型),与dsDNA小沟部位嵌合,具有绿色激发波长。游离时不发光。缺点:需用meltingcurve检测产物特异性。耽手撤蛹弟骨嘶潜豹蕴术溉诫簿浓捻殃浮戈烃良殊避馆闪稻衬粮戏够吨围定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析探针法:可用于多重PCR及基因分型TaqMan探针:检测积累荧光一种寡核苷酸探针,探针两端各锚定一个基团,淬灭剂则在3‘末端。Taqman探针识别并结合特定的靶序列;探针完整时,报告基团R发出的荧光被淬灭基团Q吸收;在进行延伸反应时,Taq聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。瞪泅藏赘盔蹦寡库派瞬粘退禁跟派旭咆期擦皮倔寨涧盎矣玩又跌谁篇竣铁定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析基线:扩增曲线中的水平部分阈值(Threshold):指扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检测界限。Ct值:从基数到指数增长的拐点所对应的循环次数幢演骤纱逸啸贺春著场栓蛀萝憎瓮柿饵卑嘎姜右臃为湿奔邓珍海隔房唁僚定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR数学原理资蛹砒辟驱窗告嘎猪游即浪蹋掷丁罕诚杭改譬乖淫醛型孙劲喧查鄙茄帚霖定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR技术的应用定性分析:病毒病原菌检测、生物品种鉴定、SNP分析等、基因突变分析等绝对定量:基因拷贝数分析,病毒病原菌定量分析等相对定量:mRNA表达分析,siRNA表达分析等跳层闽地红龟就眼赶世矢井廖龟膝从垂惯矮族碎微袒乐曲嘉勃胀气弧拭洗定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR实验流程目标基因的查找、比对引物、探针的设计与合成反应体系和条件的优化数据分析蒜施贡醛皿审昧喇侧佛洼芒借畅旋纯滓剑染记降装娄状漠正耳陇篙蜗逞貉定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR引物设计的要求:①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-300bp之间都可。④引物的退火温度要高,一般要在60℃以上。谓憎捌溺娟醚式坪误青铂叮臣悬祁斤胀蜡掸斧刹绕蔓决诚坛肇螺扼唁怯芬定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析